Il-pestiċidi għandhom rwol kritiku fl-indirizzar tan-nuqqas globali ta' ikel u fil-ġlieda kontra l-mard uman li jinġarr mill-vetturi. Madankollu, il-problema dejjem tikber tar-reżistenza għall-pestiċidi teħtieġ b'mod urġenti l-iskoperta ta' komposti ġodda li jimmiraw lejn miri mhux utilizzati biżżejjed. Il-kanali tal-potenzjal tar-riċettur temporanju tal-insetti (TRPV)—Nanzhong (Nan) u inattivi (Iav)—jistgħu jiffurmaw kanali eterologi (Nan-Iav) u jillokalizzaw f'organi mekkanosensorji li jimmedjaw il-ġeotropiżmu, is-smigħ, u l-proprjoċezzjoni fl-insetti. Xi pestiċidi, bħall-aphidopyrrolidone (AP), jimmiraw lejn in-Nan-Iav permezz ta' mekkaniżmi mhux magħrufa. L-AP huwa effettiv kontra insetti li jtaqqbu u jerdgħu (emipterani), u jipprevjeni t-tmigħ billi jfixkel il-funzjoni tal-filamenti. L-AP jista' jorbot biss ma' Nan, iżda n-Nan-Iav biss jista' jinteraġixxi ma' agonisti, inkluż in-nikotinamide endoġenu (NAM), u b'hekk juri attività tal-kanal. Minkejja l-potenzjal ta' Nan-Iav bħala mira ta' insettiċida, ftit li xejn huwa magħruf dwar l-assemblaġġ tal-kanali tiegħu, is-siti ta' rbit regolatorji, u r-regolazzjoni dipendenti fuq Ca2+, li jfixklu l-iżvilupp ulterjuri tal-insettiċida. F'dan l-istudju, intużat mikroskopija krijo-elettronika biex tiddetermina l-istruttura ta' Nan-Iav f'insetti Hemiptera fl-istat ħieles mill-ligand tal-kalmodulina, kif ukoll bl-AP u n-NAM fil-konfini tad-dominju ċitoplasmiku ripetut tal-ankyrin (ARD). B'mod sorprendenti, sibna li l-proteina Nan innifisha tista' tifforma pentamer, li huwa stabbilizzat minn interazzjonijiet ARD medjati mill-AP. Dan l-istudju jiżvela interazzjonijiet molekulari bejn insettiċidi u agonisti u Nan-Iav, u jenfasizza l-importanza tal-ARD fil-funzjoni u l-assemblaġġ tal-kanali, u jesplora l-mekkaniżmu tar-regolazzjoni tas-Ca2+.
Fl-isfond ta' tibdil fil-klima globali li qed isir dejjem aktar sever, id-deterjorament tas-sigurtà tal-ikel globali huwa wieħed mill-isfidi ewlenin tas-seklu 21, b'konsegwenzi kaskata għas-soċjetà.1,2Ir-rapport tal-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa dwar l-Istat tas-Sigurtà tal-Ikel u n-Nutrizzjoni fid-Dinja 2023 (SOFI) jistma li madwar 2.33 biljun ruħ madwar id-dinja jsofru minn insigurtà tal-ikel moderata sa severa, problema li ilha teżisti.3,4Sfortunatament, huwa stmat li bejn 20% u 30% jew aktar tar-rendiment tal-għelejjel jintilef kull sena minħabba l-pesti u l-patoġeni, u t-tisħin globali huwa mistenni li jaggrava r-reżistenza għall-pesti u l-vulnerabbiltà tal-għelejjel.4,5,6,7,8L-iżvilupp tal-pestiċidi huwa kritiku mhux biss biex jipproteġi l-għelejjel mill-pesti u jnaqqas it-tixrid ta' patoġeni li jinġarru minn vettur, iżda wkoll biex jiġġieled mard uman li jinġarr minn vettur bħad-deni dengue, il-malarja, u l-marda ta' Chagas, li qed isiru dejjem aktar reżistenti għall-pestiċidi.5,9,10,11
Fost il-miri ewlenin tal-insettiċidi newrotossiċi, il-kanal eterotetrameriku TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) jirrappreżenta klassi ta' miri insettiċidi skoperti biss fl-aħħar għaxar snin, inklużi insettiċidi disponibbli kummerċjalment bħal imidacloprid u pyraclostrobin.12,13,14L-insettiċida semisintetika aphidopyrrolifen (AP) huwa prodott żviluppat u kummerċjalizzat reċentement li l-komponent ewlieni tiegħu huwa l-insettiċida attiv Inscalis®, li jorbot mal-AP f'livell ta' attività subnanomolari.15L-AP juri tossiċità akuta baxxa għall-pollinaturi, insetti ta' benefiċċju, u organiżmi oħra mhux fil-mira, u meta jintuża skont l-istruzzjonijiet fuq it-tikketta, jista' jnaqqas il-pressjoni tar-reżistenza għal insettiċidi oħra.16,17,18Nan u Iav huma mqassma b'mod wiesa' fost l-ispeċi ta' insetti, huma ko-espressi biss fin-newroni riċetturi tal-istirament kordali tal-antenni u r-riġlejn, u huma kritiċi għas-smigħ, il-perċezzjoni tal-gravità, u l-proprjoċezzjoni.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, u pyraclostrobin jistimulaw il-kumpless Nan-Iav permezz ta' mekkaniżmu uniku, u fl-aħħar mill-aħħar jinibixxu t-trażduzzjoni tas-sinjal proprjoċettiv.13,16,23Fl-insetti li jtaqqbu u jerdgħu (emipterani) bħall-afidi u d-dubbien bojod, it-telf tal-proprjoċezzjoni jfixkel il-kapaċità tagħhom li jieklu, u fl-aħħar mill-aħħar iwassal għall-mewt.13,24Interessanti, l-AP juri affinità għolja għall-kumpless Nan-Iav u affinità baxxa għal Nan waħdu. L-irbit tal-AP ma' Nan-Iav jikkaġuna kurrent elettriku, iżda l-irbit ma' Nan waħdu ma jistimulax l-attività tal-kanal. Iav innifsu ma jorbotx mal-AP xejn.16Dan jissuġġerixxi li Nan u Iav jistgħu jingħaqdu biex jiffurmaw kumplessi differenti tal-kanali Nan-Iav (eż., b'proporzjonijiet stojkjometriċi differenti jew arranġamenti differenti fl-istess proporzjon stojkjometriku) jew li AP jista' jingħaqad ma' siti multipli. Barra minn hekk, l-agonist naturali nikotinamide (NAM) jingħaqad ma' Drosophila Nan-Iav b'affinità mikromolari, u juri effetti simili għal dawk tal-afidi (AP) in vitro.16,25u jinibixxi r-riproduzzjoni u l-għalf tal-afidi, u fl-aħħar mill-aħħar iwassal għall-mewt tagħhom25,26Din id-dejta tqajjem ħafna mistoqsijiet. Pereżempju, għadu mhux ċar kif jiġi ffurmat l-eterodimeru Nan-Iav, liema siti ta' rbit jintużaw biex jimmodulaw molekuli żgħar, u kif dawn il-molekuli żgħar jirregolaw il-funzjoni tal-kanal billi jrażżnu l-proprjoċezzjoni. Barra minn hekk, ir-raġunijiet għaliex in-Nan innifsu huwa inattiv u għandu affinità baxxa għall-AP, filwaqt li l-eterodimeru Nan-Iav huwa attiv u jorbot mal-AP b'affinità ogħla, għadhom mhux ċari. Fl-aħħar nett, ftit li xejn huwa magħruf dwar ir-regolazzjoni dipendenti fuq Ca2+ tal-funzjoni Nan-Iav u kif hija integrata fil-proċessi tas-sinjalar newronali.13,21
F'dan l-istudju, billi kkombinajna l-mikroskopija krijo-elettronika, l-elettrofiżjoloġija, u t-tekniki ta' rbit tar-radjoligand, spjegajna l-assemblaġġ ta' Nan-Iav u l-mekkaniżmu tar-rabta tiegħu ma' regolaturi ta' molekuli żgħar. Barra minn hekk, skoprejna calmodulin (CaM) marbut b'mod kostituttiv ma' Iav u Nan pentameri stabilizzati bl-AP. Dawn ir-riżultati jipprovdu għarfien importanti dwar ir-regolazzjoni tal-joni tal-kalċju fil-kanali, l-assemblaġġ tal-kanali, u l-fatturi li jiddeterminaw l-affinità tar-rabta tal-ligand. Aktar importanti minn hekk, ikkonfermajna li l-ARD għandu rwol ċentrali f'dawn il-proċessi. L-istudju tagħna ta' kanali kompluti tal-insetti marbuta ma' pestiċidi agrikoli rilevanti27, 28, 29jiftaħ prospetti għall-iżvilupp tal-industrija tal-pestiċidi, itejjeb l-effikaċja u l-ispeċifiċità tal-pestiċidi, u jippermetti l-applikazzjoni ta' komposti mmirati lejn it-TRPV għal speċi oħra biex jindirizzaw is-sigurtà globali tal-ikel u t-tixrid ta' mard li jinġarr minn vettur.
Sibna wkoll li Nan-Iav huwa regolat minn Ca2+, u l-mekkaniżmu ta' regolazzjoni huwa medjat minn CaM marbut b'mod kostituttiv. Importanti, din ir-regolazzjoni dipendenti fuq Ca2+ ta' Nav minn CaM hija differenti b'mod sinifikanti mill-mekkaniżmi ta' regolazzjoni ta' kanali joniċi oħra (eż., kanali Na+ b'vultaġġ attiv u kanali TRPV5/6).52,53,54,55,56,57Fil-kanal Nav1.2, id-dominju C-terminali ta' CaM jassoċja b'mod elikoidali mad-dominju C-terminali (CTD), u Ca2+ jikkaġuna l-irbit tad-dominju N-terminali tiegħu mal-porzjon distali tas-CTD.56Fil-kanal TRPV5/6, id-dominju C-terminali ta' CaM jingħaqad ma' CTH, u Ca2+ jikkaġuna estensjoni 'l fuq tad-dominju N-terminali tiegħu fil-poru, u b'hekk jimblokka l-permeabilità tal-katjoni.53,54Nipproponu mudell għall-funzjoni regolata minn Ca2+ ta' Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). F'dan il-mudell, id-dominju N-terminali ta' CaM jintrabat b'mod kostituttiv mad-dominju C-terminali (CTH) ta' Iav. Fl-istat ta' mistrieħ (konċentrazzjoni baxxa ta' [Ca2+]), id-dominju C-terminali ta' CaM jinteraġixxi ma' Nan, u jistabbilizza l-konformazzjoni tal-ARD u b'hekk jippromwovi l-ftuħ tal-kanal. L-irbit ta' agonist/insettiċida mal-kanal jikkaġuna l-ftuħ tal-pori, li jwassal għal influss ta' Ca2+. Ca2+ imbagħad jintrabat ma' CaM, u jikkawża dissoċjazzjoni tad-dominju C-terminali mill-ARD ta' Nan. Minħabba li l-imblukkar tal-irbit ta' CaM essenzjalment jabolixxi l-effett inibitorju ta' Ca2+, din id-dissoċjazzjoni timmodula l-mobilità tal-ARD, u b'hekk tikkawża inibizzjoni jew desensibilizzazzjoni dipendenti fuq Ca2+. L-irkupru rapidu tal-kurrenti tal-kanal wara l-elużjoni tal-jone tal-kalċju (Fig. 4g) jissuġġerixxi li dan il-mekkaniżmu jiffaċilita risponsi rapidi għal sinjali newronali medjati minn Ca2+. Barra minn hekk, ir-reġjun C-terminal ta' Iav, li għadu mhux mifhum sew, ġie rrappurtat li għandu rwoli oħra fl-immirar tal-kanali u r-regolazzjoni attwali.21
Fl-aħħar nett, l-istudju tagħna jippreżenta l-istruttura b'riżoluzzjoni għolja ta' kumpless ta' kanal TRP bejn insettiċida u insettiċida ta' importanza agrikola—skoperta li qabel ma kinitx magħrufa għalina. Ta' min jinnota li kkaratterizzajna l-istruttura u l-funzjoni tal-kanal tal-insetti fiċ-ċelloli umani (HEK293S GnTi–) aktar milli fiċ-ċelloli tal-insetti. Fid-dawl tar-reżistenza dejjem tikber għall-insettiċidi u l-pressjoni kontinwa fuq is-sigurtà tal-ikel u l-patoġeni, ix-xogħol tagħna jipprovdi informazzjoni importanti li se tiffaċilita l-iżvilupp ta' insettiċidi ġodda għall-benefiċċju tas-saħħa tal-bniedem u s-sigurtà tal-ikel globali. Studji wrew li insettiċidi bħall-AP huma effettivi kontra xi pesti meta jintużaw skont l-istruzzjonijiet fuq it-tikketta u għandhom tossiċità akuta baxxa għal pollinaturi ta' benefiċċju, u dan juri s-sikurezza ambjentali tagħhom.13,16Barra minn hekk, l-ittestjar ta' xi derivattivi tal-AP fuq in-nemus wera li eventwalment jitilfu l-abbiltà tagħhom li jtiru. Il-fehim ta' kif dawn il-komposti modulanti jorbtu ma' Nan-Iav se jiffaċilita l-modifika ta' komposti eżistenti jew l-iżvilupp ta' komposti ġodda għal aktar effettivi upreċiżkontroll tal-pesti. L-istudju tagħna juri li l-interfaċċja Nan-Iav ARD hija kritika mhux biss għar-regolazzjoni tal-attività ta' komposti endoġeni, pestiċidi, u Ca2+-CaM, iżda wkoll għall-assemblaġġ tal-kanali. Nissuġġerixxu li t-tfixkil tal-assemblaġġ tal-eterodimeri b'molekuli żgħar jista' jkun approċċ uniku u promettenti għall-iżvilupp ta' inibituri tal-kanali tal-joni.
Mit-tmien ġeni ortologi, intgħażlu l-ġeni sħaħ tal-ħanfusa kannella (Halyomorpha halys) Nanchung u Inactive, li wrew stabbiltà eċċellenti fid-deterġenti. Il-ġeni sintetizzati ġew ottimizzati għall-kodon għall-espressjoni umana u kklonati fil-vettur pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) bl-użu tas-siti ta' restrizzjoni XhoI u EcoRI. Dan żgura li l-kloni kienu fil-qafas mat-tikketti C-terminali GFP-FLAG-10xHis u mCherry-FLAG-10xHis, li huma maqsuma mill-protease HRC-3C (PPX), li jippermettu identifikazzjoni indipendenti.espressjoniIl-primers użati biex jiġu kklonati Nanchung u Inactive fil-vettur pBacMam kienu kif ġej:
Immaġni mikroskopiċi ta' partiċelli individwali nkisbu fuq mikroskopju elettroniku ta' trasmissjoni (FEI) Titan Krios G2 mgħammar b'kamera K3 u filtru tal-enerġija Gatan BioQuantum. Il-mikroskopju tħaddem fi 300 keV, b'setting tal-enerġija ta' 20 eV, daqs tal-pixel tal-kampjun ta' 1.08 Å/pixel (ingrandiment nominali ta' 81,000x), u gradjent ta' defokus li jvarja minn -0.8 sa -2.2 μm. Ir-reġistrazzjoni tal-vidjo twettqet b'40 frejm kull sekonda bl-użu ta' mikroskopju Latitude S (Gatan) b'rata ta' doża nominali ta' 25 e–px−1 s−1, ħin ta' espożizzjoni ta' 2.4 s, u doża totali ta' madwar 60 e–Å−2.
Il-korrezzjoni tal-moviment indotta mir-raġġ u l-ippeżar tad-doża twettqu fuq film bl-użu ta' MotionCor2 f'RELION 4.061. L-istima tal-parametru tal-funzjoni tat-trasferiment tal-kuntrast (CTF) twettqet f'cryoSPARC bl-użu tal-metodu ta' stima CTF ibbażat fuq irqajja62. Fotomikrografi b'riżoluzzjoni ta' twaħħil CTF ≥4 Å ġew esklużi mill-analiżi sussegwenti. Tipikament, sottosett ta' 500–1000 fotomikrograf intuża għall-għażla tal-punti f'cryoSPARC, segwit minn diversi rawnds ta' klassifikazzjoni 2D wara l-iffiltrar biex tinkiseb immaġni ta' referenza ċara għall-għażla tal-partiċelli bbażata fuq mudell. Il-partiċelli mbagħad ġew estratti bl-użu ta' kaxxi ta' delimitazzjoni ta' 64-pixel u binning ta' 4 darbiet. Twettqu diversi rawnds ta' klassifikazzjoni 2D biex jitneħħew kategoriji ta' partiċelli mhux mixtieqa. Il-mudell 3D inizjali ġie rikostruwit bl-użu ta' rikostruzzjoni ab initio u raffinat bl-użu ta' raffinament mhux uniformi f'cryoSPARC. Il-klassifikazzjoni 3D twettqet f'cryoSPARC jew RELION ibbażata fuq l-eteroġeneità ARD. Ma ġiet osservata l-ebda eteroġeneità sinifikanti tad-dominji tal-membrana. Il-partiċelli ġew raffinati bl-użu tal-metodi C1 u C2; Il-partiċelli b'riżoluzzjoni C2 ogħla tqiesu bħala simmetriċi fir-rigward ta' C2 u ġew importati f'RELION għar-raffinar Bayesjan. Il-partiċelli mbagħad ġew trasferiti lura lejn cryoSPARC għar-raffinar finali mhux uniformi u lokali. Ir-riżoluzzjoni finali u l-għadd ta' partiċelli huma murija fit-Tabella 1.
Meta pproċessajna pentameri Nan+AP, esplorajna diversi metodi biex intejbu r-riżoluzzjoni tad-dominji tal-membrana (speċjalment ir-reġjun tal-pori), bħat-tnaqqis tas-sinjal u l-masking tat-TMD. Madankollu, dawn it-tentattivi ma rnexxewx minħabba d-diżordni potenzjalment estrema fir-reġjun tal-pori u l-eteroġeneità ġenerali tat-TMD. Ir-riżoluzzjoni finali ġiet ikkalkulata bl-użu ta' maskra ġġenerata awtomatikament mill-metodu ta' pproċessar mhux uniformi f'cryoSPARC, primarjament immirata lejn ir-reġjun ARD. Dan kiseb riżoluzzjoni sinifikament ogħla minn dik tad-dominji tal-membrana (speċjalment ir-reġjun VSLD).
Mudelli de novo inizjali tal-forom apo tal-bugs Nanchung u Inactive ġew iġġenerati għall-ewwel darba bl-użu ta' Coot63, u mudelli tal-bugs Nan u Iav ġew iġġenerati bl-użu ta' AlphaFold264 biex jiġu identifikati reġjuni b'kunfidenza baxxa. L-immudellar tal-kalmodulina kien ibbażat fuq tajbin ta' ġisem riġidu tal-mudelli li jorbtu Ca2+ u ħielsa minn Ca2+ fl-aċċessjonijiet tal-PDB 4JPZ56 u 1CFD65, rispettivament. Il-mudelli ġew raffinati bl-użu ta' raffinament sferiku biex tiġi żgurata l-istereokimika korretta u ġeometrija tajba. Il-fosfatidilkolina, il-fosfatidiletanolamina, u l-fosfatidilserina mbagħad ġew immudellati bħala densitajiet tal-lipidi definiti sew, u l-ligandi NAM u AP tqiegħdu fid-densitajiet korrispondenti fil-junctions stretti. Fajls ta' restrizzjonijiet ġew iġġenerati mis-sekwenza SMILES tal-isoformi bl-użu ta' eLBOW f'PHENIX66. Fl-aħħarnett, il-mudelli ġew raffinati fi spazju reali f'PHENIX bl-użu ta' tfittxija lokali tal-grilja u minimizzazzjoni globali b'restrizzjonijiet tal-istruttura sekondarja. Is-server MolProbity intuża għar-raffinar tal-mudell u l-analiżi strutturali, u l-illustrazzjonijiet twettqu bl-użu ta' PyMOL u UCSF Chimera X. 67,68,69 L-analiżi tal-apertura twettqet bl-użu tas-server HOLE,70 u l-immappjar tal-konservazzjoni tas-sekwenza twettaq bl-użu tas-server Consurf.71
L-analiżi statistika twettqet bl-użu ta' Igor Pro 6.2, Excel Office 365, u GraphPad Prism 7.0. Id-dejta kwantitattiva kollha hija ppreżentata bħala medja ± żball standard (SEM). It-test-t ta' Student (b'żewġt itruf, mhux imqabbel) intuża biex jitqabblu żewġ gruppi. Analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA) segwita mit-test post hoc ta' Dunnett intużat biex jitqabblu gruppi multipli. *P< 0.05, **P< 0.01, u ***P< 0.001 tqiesu statistikament sinifikanti skont id-distribuzzjoni tad-dejta. Il-valuri Kd, Ki, u l-intervalli ta' kunfidenza asimmetriċi ta' 95% tagħhom ġew ikkalkulati bl-użu ta' GraphPad Prism 10.
Għal aktar dettalji dwar il-metodoloġija tal-istudju, jekk jogħġbok ara s-Sommarju tar-Rapport tal-Portafoll tan-Natura li jinsab f'dan l-artiklu.
Il-mudell inizjali nbena bl-użu tal-mudelli tal-kalmodulina mid-databases PDB 4JPZ u 1CFD. Il-koordinati ġew depożitati fil-Protein Data Bank (PDB) taħt in-numri ta' aċċessjoni 9NVN (Nan-Iav-CaM mingħajr ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM marbut man-nikotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM marbut man-nikotinamide u l-EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM marbut ma' aphenidolpyrroline u l-kalċju), 9NVR (Nan-Iav-CaM marbut ma' aphenidolpyrroline u l-EDTA), u 9NVS (Nan pentamer marbut ma' aphenidolpyrroline). L-immaġini korrispondenti tal-mikroskopija krijo-elettronika huma depożitati fid-Database tal-Mikroskopija Elettronika (EMDB) taħt in-numri ta' aċċessjoni li ġejjin: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM mingħajr ligand), EMD-49845 (kumpless Nan-Iav-CaM bin-nikotinamide), EMD-49846 (kumpless Nan-Iav-CaM bin-nikotinamide u EDTA), EMD-49847 (kumpless Nan-Iav-CaM b'aphidopyrroline u kalċju), EMD-49848 (kumpless Nan-Iav-CaM b'aphidopyrroline u EDTA), u EMD-49849 (kumpless Nan pentamer b'aphidopyrroline). Id-dejta mhux ipproċessata għall-analiżi funzjonali hija ppreżentata f'dan id-dokument.
Ħin tal-posta: 28 ta' Jannar 2026