Il-mediċina antielmintika N,N-dietil-m-toluamide (DEET) ġie rrappurtat li jinibixxi l-AChE (acetylcholinesterase) u għandu proprjetajiet karċinoġeniċi potenzjali minħabba vaskularizzazzjoni eċċessiva. F'dan id-dokument, nuru li DEET jistimula speċifikament iċ-ċelloli endoteljali li jippromwovu l-anġjoġenesi, u b'hekk iżidu t-tkabbir tat-tumur. DEET jattiva proċessi ċellulari li jwasslu għal anġjoġenesi, inklużi proliferazzjoni, migrazzjoni u adeżjoni. Dan huwa assoċjat ma 'żieda fil-produzzjoni ta' NO u espressjoni ta 'VEGF fiċ-ċelloli endoteljali. Is-sikket ta 'M3 jew l-użu ta' inibituri M3 farmakoloġiċi neħħew dawn l-effetti kollha, li jissuġġerixxu li l-anġjoġenesi indotta minn DEET hija sensittiva għal M3. Esperimenti li jinvolvu sinjalazzjoni tal-kalċju f'ċelloli endoteljali u HEK li jesprimu żżejjed riċetturi M3, kif ukoll studji ta 'rbit u docking, jindikaw li DEET jaġixxi bħala modulatur allosteriku ta' riċetturi M3. Barra minn hekk, DEET jinibixxi l-AChE, u b'hekk iżid il-bijodisponibilità tal-acetylcholine u l-irbit tiegħu mar-riċetturi M3, u jsaħħaħ l-effetti proanġjoġeniċi permezz tar-regolament allosteriku.
ECs primarji kienu iżolati mill-aorta tal-ġrieden Żvizzeri. Il-metodu ta' estrazzjoni ġie adattat mill-protokoll Kobayashi 26 . Murine ECs ġew ikkultivati f'EBM-2 medium supplimentat b'5% FBS inattivat bis-sħana sal-raba 'passaġġ.
L-effett ta 'żewġ konċentrazzjonijiet ta' DEET fuq il-proliferazzjoni ta 'HUVEC, U87MG, jew BF16F10 ġie analizzat bl-użu ta' CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Fil-qosor, 5.103 ċelluli għal kull bir kienu miżrugħa fi pjanċa ta '96 bir, jitħallew jehmeż matul il-lejl, u mbagħad ittrattati b'DEET għal 24 siegħa. Wara li tneħħi l-mezz tat-tkabbir, żid soluzzjoni li torbot iż-żebgħa ma 'kull bir tal-mikroplate u inkuba ċ-ċelloli f'37 °C għal 30 min. Il-livelli ta 'fluworexxenza ġew determinati bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, il-Ġermanja) mgħammar b'filtri ta 'eċċitazzjoni ta' 485 nm u filtri ta 'emissjoni ta' 530 nm.
HUVEC ġew miżrugħa fi pjanċi ta '96 bir f'densità ta' 104 ċelluli għal kull bir. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'DEET għal 24 siegħa. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet ivvalutata bl-użu ta' analiżi MTT kolorimetrika (Sigma-Aldrich, M5655). Il-valuri tad-densità ottika nkisbu fuq qarrej ta 'mikroplate multimode (Mithras LB940) f'wavelength ta' 570 nm.
L-effetti ta' DEET ġew studjati bl-użu ta' analiżi ta' anġjoġenesi in vitro. Trattament b'10-8 M jew 10-5 M DEET żied il-formazzjoni ta 'tul kapillari f'HUVECs (Fig. 1a, b, vireg bojod). Meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, trattament b'konċentrazzjonijiet DEET li jvarjaw minn 10-14 sa 10-5 M wera li t-tul kapillari laħaq plateau f'10-8 M DEET (Figura Supplimentari S2). Ma nstabet l-ebda differenza sinifikanti fl-effett proanġjoġeniku in vitro ta’ HUVECs ittrattati b’DEET fil-medda ta’ konċentrazzjoni ta’ 10-8 M u 10-5 M.
Biex niddeterminaw l-effett tad-DEET fuq in-neovaskularizzazzjoni, għamilna studji ta 'neovaskularizzazzjoni in vivo. Wara 14-il jum, ġrieden injettati b'ċelluli endoteljali kkultivati minn qabel b'10-8 M jew 10-5 M DEET wrew żieda sinifikanti fil-kontenut tal-emoglobina (Fig. 1c, vireg bojod).
Barra minn hekk, in-neovaskularizzazzjoni indotta minn DEET ġiet studjata fi ġrieden li jkollhom xenograft U87MG li ġew injettati kuljum (ip) b'DEET f'doża magħrufa li tinduċi konċentrazzjonijiet fil-plażma ta '10-5 M, li hija normali fil-bnedmin esposti. fi 23. Tumuri li jistgħu jinstabu (jiġifieri tumuri > 100 mm3) ġew osservati 14-il jum wara l-injezzjoni ta 'ċelluli U87MG fil-ġrieden. F'jum 28, it-tkabbir tat-tumur kien imtejjeb b'mod sinifikanti fil-ġrieden ittrattati bid-DEET meta mqabbla ma 'ġrieden ta' kontroll (Fig. 1d, kwadri). Barra minn hekk, it-tbajja 'CD31 ta' tumuri wriet li DEET żied b'mod sinifikanti l-erja kapillari iżda mhux id-densità tal-mikrovessel. (Fig. 1e–g).
Biex jiġi ddeterminat ir-rwol tar-riċetturi muskariniċi fil-proliferazzjoni indotta minn DETA, intuża 10-8 M jew 10-5 M DETA fil-preżenza ta 'pFHHSiD (10-7 M, antagonist selettiv tar-riċettur M3). Trattament ta' HUVEC. pFHHSiD imblokka kompletament il-proprjetajiet proliferattivi ta 'DETA fil-konċentrazzjonijiet kollha (Tabella 1).
Taħt dawn il-kundizzjonijiet, eżaminajna wkoll jekk DEET iżżidx it-tul kapillari fiċ-ċelloli HUVEC. Bl-istess mod, pFHHSiD ipprevjeni b'mod sinifikanti t-tul kapillari indott mid-DEET (Fig. 1a, b, vireg griżi). Barra minn hekk, saru esperimenti simili b'M3 siRNA. Għalkemm is-siRNA ta 'kontroll ma kienx effettiv fil-promozzjoni tal-formazzjoni kapillari, is-sajlenser tar-riċettur muscarinic M3 abolixxa l-abbiltà ta' DEET li jżid it-tul kapillari (Fig. 1a, b, vireg suwed).
Barra minn hekk, kemm 10-8 M jew 10-5 M vaskularizzazzjoni indotta minn DEET in vitro u neovascularization in vivo kienu kompletament imblukkati minn pFHHSiD (Fig. 1c, d, ċrieki). Dawn ir-riżultati jindikaw li DEET jippromwovi l-anġjoġenesi permezz ta 'mogħdija sensittiva għal antagonisti selettivi tar-riċetturi M3 jew M3 siRNA.
AChE hija l-mira molekulari tad-DEET. Mediċini bħal donepezil, li jaġixxu bħala inibituri ta' AChE, jistgħu jistimulaw l-anġjoġenesi EC in vitro u f'mudelli ta' iskemija tar-riġlejn ta' wara tal-ġrieden14. Aħna ttestjajna l-effett ta 'żewġ konċentrazzjonijiet ta' DEET fuq l-attività tal-enzimi AChE f'HUVEC. Konċentrazzjonijiet baxxi (10-8 M) u għoljin (10-5 M) ta 'DEET naqsu l-attività AChE endoteljali meta mqabbla mal-kundizzjonijiet ta' kontroll (Fig. 2).
Iż-żewġ konċentrazzjonijiet ta 'DEET (10-8 M u 10-5 M) naqqsu l-attività acetylcholinesterase fuq HUVEC. BW284c51 (10-5 M) intuża bħala kontroll għall-inibituri tal-acetylcholinesterase. Ir-riżultati huma espressi bħala perċentwali tal-attività AChE fuq HUVEC trattat biż-żewġ konċentrazzjonijiet ta 'DEET meta mqabbla ma' ċelloli ttrattati bil-vettura. Il-valuri huma espressi bħala medja ± SEM ta 'sitt esperimenti indipendenti. *p <0.05 meta mqabbel mal-kontroll (test ta' tqabbil multiplu ta' Kruskal-Wallis u Dunn).
L-ossidu nitriku (NO) huwa involut fil-proċess anġjoġeniku 33, għalhekk, il-produzzjoni NO f'HUVECs stimulati mid-DEET ġiet studjata. Il-produzzjoni ta 'NO endoteljali trattat b'DEET żdiedet meta mqabbla ma' ċelloli ta 'kontroll, iżda laħqet sinifikat biss f'doża ta' 10-8 M (Fig. 3c). Biex tiddetermina l-bidliet molekulari li jikkontrollaw il-produzzjoni NO indotta mid-DEET, l-espressjoni u l-attivazzjoni ta 'eNOS ġew analizzati permezz ta' Western blotting. Għalkemm it-trattament DEET ma biddilx l-espressjoni ta 'eNOS, żied b'mod sinifikanti l-fosforilazzjoni ta' eNOS fis-sit ta 'attivazzjoni tiegħu (Ser-1177) filwaqt li naqqas is-sit inibitorju tiegħu (Thr-495) meta mqabbel ma' ċelloli mhux ittrattati fil-fosforilazzjoni ta 'eNOS (Fig. 3d). Barra minn hekk, il-proporzjon ta 'eNOS fosforilati fis-sit ta' attivazzjoni u sit inibitorju ġie kkalkulat wara n-normalizzazzjoni tal-ammont ta 'eNOS fosforilati għall-ammont totali ta' enzima. Dan il-proporzjon żdied b'mod sinifikanti f'HUVECs ittrattati b'kull konċentrazzjoni ta 'DEET meta mqabbla ma' ċelloli mhux ittrattati (Fig. 3d).
Fl-aħħarnett, l-espressjoni ta 'VEGF, wieħed mill-fatturi proangiogenic prinċipali, ġiet analizzata minn Western blotting. DEET żied b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-VEGF, filwaqt li pFHHSiD imblokka kompletament din l-espressjoni.
Peress li l-effetti tad-DEET huma sensittivi kemm għall-imblokk farmakoloġiku kif ukoll għar-regolazzjoni 'l isfel tar-riċetturi M3, aħna ttestjajna l-ipoteżi li DEET jista' jtejjeb is-sinjalar tal-kalċju. B'mod sorprendenti, DEET naqas milli jżid il-kalċju ċitoplasmiku f'HUVEC (dejta mhux murija) u HEK/M3 (Fig. 4a, b) għaż-żewġ konċentrazzjonijiet użati.
Ħin tal-post: Diċ-30-2024