Il-mediċina antielmintika N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ġie rrappurtat li jinibixxi l-AChE (acetylcholinesterase) u għandu proprjetajiet karċinoġeniċi potenzjali minħabba vaskularizzazzjoni eċċessiva. F'dan id-dokument, nuru li d-DEET jistimula speċifikament iċ-ċelloli endoteljali li jippromwovu l-anġjoġenesi, u b'hekk iżidu t-tkabbir tat-tumur. Id-DEET jattiva proċessi ċellulari li jwasslu għall-anġjoġenesi, inkluż il-proliferazzjoni, il-migrazzjoni, u l-adeżjoni. Dan huwa assoċjat ma' żieda fil-produzzjoni ta' NO u espressjoni ta' VEGF fiċ-ċelloli endoteljali. Is-silenċjar ta' M3 jew l-użu ta' inibituri farmakoloġiċi ta' M3 abolixxa dawn l-effetti kollha, u dan jissuġġerixxi li l-anġjoġenesi indotta mid-DEET hija sensittiva għall-M3. Esperimenti li jinvolvu sinjalazzjoni tal-kalċju f'ċelloli endoteljali u HEK li jesprimu żżejjed riċetturi M3, kif ukoll studji ta' rbit u docking, jindikaw li d-DEET jaġixxi bħala modulatur allosteriku tar-riċetturi M3. Barra minn hekk, id-DEET jinibixxi l-AChE, u b'hekk iżid il-bijodisponibbiltà tal-acetylcholine u r-rbit tagħha mar-riċetturi M3, u jtejjeb l-effetti proanġjoġeniċi permezz tar-regolazzjoni allosterika.
L-ECs primarji ġew iżolati mill-aorta tal-ġrieden Żvizzeri. Il-metodu ta' estrazzjoni ġie adattat mill-protokoll ta' Kobayashi 26. L-ECs murini ġew ikkultivati f'mezz EBM-2 supplimentat b'5% FBS inattivat bis-sħana sal-raba' passaġġ.
L-effett ta' żewġ konċentrazzjonijiet ta' DEET fuq il-proliferazzjoni ta' HUVEC, U87MG, jew BF16F10 ġie analizzat bl-użu tas-CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Fil-qosor, 5.103 ċelluli għal kull bir ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 96 bir, tħallew jeħlu matul il-lejl, u mbagħad ittrattati bid-DEET għal 24 siegħa. Wara li tneħħi l-mezz tat-tkabbir, żid soluzzjoni li torbot iż-żebgħa ma' kull bir tal-mikropjanċa u inkuba ċ-ċelluli f'37 °C għal 30 minuta. Il-livelli ta' fluworexxenza ġew determinati bl-użu ta' qarrej tal-mikropjanċa multimodali Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, il-Ġermanja) mgħammar b'filtri ta' eċċitazzjoni ta' 485 nm u filtri ta' emissjoni ta' 530 nm.
L-HUVEC ġew miżrugħa fi pjanċi ta' 96-bir b'densità ta' 104 ċellula għal kull bir. Iċ-ċelloli ġew ittrattati bid-DEET għal 24 siegħa. Il-vijabbiltà taċ-ċelloli ġiet ivvalutata bl-użu ta' assay kolorimetriku MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Il-valuri tad-densità ottika nkisbu fuq qarrej tal-mikropjanċi multimodali (Mithras LB940) b'tul ta' mewġa ta' 570 nm.
L-effetti tad-DEET ġew studjati bl-użu ta' assays ta' anġjoġenesi in vitro. It-trattament b'10-8 M jew 10-5 M DEET żied il-formazzjoni tat-tul kapillari fl-HUVECs (Fig. 1a, b, vireg bojod). Meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, it-trattament b'konċentrazzjonijiet ta' DEET li jvarjaw minn 10-14 sa 10-5 M wera li t-tul kapillari laħaq plateau f'10-8 M DEET (Fig. Supplimentari S2). Ma nstabet l-ebda differenza sinifikanti fl-effett proanġjoġeniku in vitro tal-HUVECs ittrattati bid-DEET fil-medda ta' konċentrazzjoni ta' 10-8 M u 10-5 M.
Biex niddeterminaw l-effett tad-DEET fuq in-neovaskularizzazzjoni, wettaqna studji ta' neovaskularizzazzjoni in vivo. Wara 14-il jum, ġrieden injettati b'ċelloli endoteljali kkultivati minn qabel b'10-8 M jew 10-5 M DEET urew żieda sinifikanti fil-kontenut tal-emoglobina (Fig. 1c, vireg bojod).
Barra minn hekk, in-neovaskularizzazzjoni indotta minn DEET ġiet studjata f'ġrieden li kellhom xenograft U87MG li ġew injettati kuljum (ip) b'DEET f'doża magħrufa li tinduċi konċentrazzjonijiet fil-plażma ta' 10-5 M, li hija normali fil-bnedmin esposti. f'23. Tumuri li setgħu jiġu skoperti (jiġifieri tumuri >100 mm3) ġew osservati 14-il jum wara l-injezzjoni taċ-ċelloli U87MG fil-ġrieden. Fil-jum 28, it-tkabbir tat-tumur żdied b'mod sinifikanti fil-ġrieden ittrattati b'DEET meta mqabbla mal-ġrieden ta' kontroll (Fig. 1d, kwadri). Barra minn hekk, it-tebgħa tas-CD31 tat-tumuri wriet li d-DEET żied b'mod sinifikanti l-erja kapillari iżda mhux id-densità tal-mikrovini. (Fig. 1e–g).
Biex jiġi determinat ir-rwol tar-riċetturi muskariniċi fil-proliferazzjoni indotta minn DETA, intuża 10-8 M jew 10-5 M DETA fil-preżenza ta' pFHHSiD (10-7 M, antagonist selettiv tar-riċetturi M3). Trattament ta' HUVEC. pFHHSiD imblokka kompletament il-proprjetajiet proliferattivi ta' DETA fil-konċentrazzjonijiet kollha (Tabella 1).
Taħt dawn il-kundizzjonijiet, eżaminajna wkoll jekk id-DEET iżidx it-tul kapillari fiċ-ċelloli HUVEC. Bl-istess mod, il-pFHHSiD ipprevjena b'mod sinifikanti t-tul kapillari indott mid-DEET (Fig. 1a, b, vireg griżi). Barra minn hekk, twettqu esperimenti simili b'M3 siRNA. Għalkemm is-siRNA ta' kontroll ma kienx effettiv fil-promozzjoni tal-formazzjoni kapillari, is-silenċjar tar-riċettur muskariniku M3 abolixxa l-abbiltà tad-DEET li jżid it-tul kapillari (Fig. 1a, b, vireg suwed).
Barra minn hekk, kemm il-vaskularizzazzjoni indotta minn DEET 10-8 M jew 10-5 M in vitro kif ukoll in-neovaskularizzazzjoni in vivo ġew imblukkati kompletament minn pFHHSiD (Fig. 1c, d, ċrieki). Dawn ir-riżultati jindikaw li d-DEET jippromwovi l-anġjoġenesi permezz ta' mogħdija sensittiva għal antagonisti selettivi tar-riċetturi M3 jew M3 siRNA.
L-AChE hija l-mira molekulari tad-DEET. Mediċini bħad-donepezil, li jaġixxu bħala inibituri tal-AChE, jistgħu jistimulaw l-anġjoġenesi tal-EC in vitro u f'mudelli ta' iskemija tar-riġlejn ta' wara tal-ġrieden14. Ittestjajna l-effett ta' żewġ konċentrazzjonijiet ta' DEET fuq l-attività tal-enzima AChE fl-HUVEC. Konċentrazzjonijiet baxxi (10-8 M) u għoljin (10-5 M) ta' DEET naqqsu l-attività endoteljali tal-AChE meta mqabbla mal-kundizzjonijiet ta' kontroll (Fig. 2).
Iż-żewġ konċentrazzjonijiet ta' DEET (10-8 M u 10-5 M) naqqsu l-attività ta' acetylcholinesterase fuq HUVEC. BW284c51 (10-5 M) intuża bħala kontroll għall-inibituri ta' acetylcholinesterase. Ir-riżultati huma espressi bħala perċentwal tal-attività ta' AChE fuq HUVEC ittrattati biż-żewġ konċentrazzjonijiet ta' DEET meta mqabbla maċ-ċelloli ttrattati bil-vettura. Il-valuri huma espressi bħala medja ± SEM ta' sitt esperimenti indipendenti. *p < 0.05 meta mqabbel mal-kontroll (test ta' tqabbil multiplu ta' Kruskal-Wallis u Dunn).
L-ossidu nitriku (NO) huwa involut fil-proċess anġjoġeniku 33, għalhekk, ġiet studjata l-produzzjoni ta' NO f'HUVECs stimulati bid-DEET. Il-produzzjoni endoteljali ta' NO ttrattata bid-DEET żdiedet meta mqabbla maċ-ċelloli ta' kontroll, iżda laħqet sinifikat biss f'doża ta' 10-8 M (Fig. 3c). Biex jiġu ddeterminati l-bidliet molekulari li jikkontrollaw il-produzzjoni ta' NO indotta bid-DEET, l-espressjoni u l-attivazzjoni tal-eNOS ġew analizzati permezz ta' Western blotting. Għalkemm it-trattament bid-DEET ma biddilx l-espressjoni tal-eNOS, żied b'mod sinifikanti l-fosforilazzjoni tal-eNOS fis-sit ta' attivazzjoni tagħha (Ser-1177) filwaqt li naqqas is-sit inibitorju tagħha (Thr-495) meta mqabbel maċ-ċelloli mhux ittrattati fil-fosforilazzjoni tal-eNOS (Fig. 3d). Barra minn hekk, il-proporzjon ta' eNOS fosforilata fis-sit ta' attivazzjoni u s-sit inibitorju ġie kkalkulat wara li ġie normalizzat l-ammont ta' eNOS fosforilata għall-ammont totali ta' enzima. Dan il-proporzjon żdied b'mod sinifikanti f'HUVECs ittrattati b'kull konċentrazzjoni ta' DEET meta mqabbla maċ-ċelloli mhux ittrattati (Fig. 3d).
Fl-aħħar nett, l-espressjoni ta' VEGF, wieħed mill-fatturi proanġjoġeniċi ewlenin, ġiet analizzata permezz ta' Western blotting. DEET żied b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' VEGF, filwaqt li pFHHSiD imblokka kompletament din l-espressjoni.
Peress li l-effetti tad-DEET huma sensittivi kemm għall-imblokk farmakoloġiku kif ukoll għar-regolazzjoni 'l isfel tar-riċetturi M3, ittestjajna l-ipoteżi li d-DEET jista' jsaħħaħ is-sinjalar tal-kalċju. B'mod sorprendenti, id-DEET ma rnexxilux iżid il-kalċju ċitoplasmiku fl-HUVEC (dejta mhux murija) u l-HEK/M3 (Fig. 4a, b) għaż-żewġ konċentrazzjonijiet użati.
Ħin tal-posta: 30 ta' Diċembru 2024