F'dan l-istudju, l-effetti stimulanti tat-trattament ikkombinat ta'regolaturi tat-tkabbir tal-pjanti(2,4-D u kinetina) u nanopartiċelli tal-ossidu tal-ħadid (Fe₃O₄-NPs) fuq il-morfoġenesi in vitro u l-produzzjoni ta' metaboliti sekondarji f'*Hypericum perforatum* L. ġew investigati. It-trattament ottimizzat [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] tejjeb b'mod sinifikanti l-parametri tat-tkabbir tal-pjanti: l-għoli tal-pjanta żdied b'59.6%, it-tul tal-għeruq b'114.0%, l-għadd ta' blanzuni b'180.0%, u l-piż frisk tal-kallu b'198.3% meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll. Dan it-trattament ikkombinat tejjeb ukoll l-effiċjenza tar-riġenerazzjoni (50.85%) u żied il-kontenut ta' hypericin b'66.6%. L-analiżi GC-MS żvelat kontenut għoli ta' hyperoside, β-patholene, u cetyl alcohol, li jammonta għal 93.36% taż-żona totali tal-quċċata, filwaqt li l-kontenut ta' fenoliċi u flavonoids totali żdied sa 80.1%. Dawn ir-riżultati jindikaw li r-regolaturi tat-tkabbir tal-pjanti (PGRs) u n-nanopartiċelli Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) jeżerċitaw effett sinerġistiku billi jistimulaw l-organoġenesi u l-akkumulazzjoni ta' komposti bijoattivi, li jirrappreżenta strateġija promettenti għat-titjib bijoteknoloġiku tal-pjanti mediċinali.
L-isfar ta’ San Ġwann (Hypericum perforatum L.), magħruf ukoll bħala l-isfar ta’ San Ġwann, huwa pjanta erbaċej perenni tal-familja Hypericaceae li għandha valur ekonomiku.[1] Il-komponenti bijoattivi potenzjali tiegħu jinkludu tannini naturali, ksantoni, florogluċinol, naftalenediantron (iperina u pseudoiperina), flavonojdi, aċidi fenoliċi, u żjut essenzjali.[2,3,4] L-isfar ta’ San Ġwann jista’ jiġi propagat b’metodi tradizzjonali; madankollu, l-istaġjonalità tal-metodi tradizzjonali, il-ġerminazzjoni baxxa taż-żerriegħa, u s-suxxettibilità għall-mard jillimitaw il-potenzjal tiegħu għal kultivazzjoni fuq skala kbira u l-formazzjoni kontinwa ta’ metaboliti sekondarji.[1,5,6]
Għalhekk, il-kultura tat-tessuti in vitro hija kkunsidrata bħala metodu effettiv għall-propagazzjoni rapida tal-pjanti, il-konservazzjoni tar-riżorsi tal-ġermplażma, u ż-żieda fir-rendiment ta' komposti mediċinali [7, 8]. Ir-regolaturi tat-tkabbir tal-pjanti (PGRs) għandhom rwol kruċjali fir-regolazzjoni tal-morfoġenesi u huma meħtieġa għall-kultivazzjoni in vitro tal-kallus u l-organiżmi sħaħ. L-ottimizzazzjoni tal-konċentrazzjonijiet u l-kombinazzjonijiet tagħhom hija kruċjali għat-tlestija b'suċċess ta' dawn il-proċessi ta' żvilupp [9]. Għalhekk, il-fehim tal-kompożizzjoni u l-konċentrazzjoni xierqa tar-regolaturi huwa importanti għat-titjib tat-tkabbir u l-kapaċità riġenerattiva tal-wort ta' San Ġwann (H. perforatum) [10].
In-nanopartiċelli tal-ossidu tal-ħadid (Fe₃O₄) huma klassi ta' nanopartiċelli li ġew jew qed jiġu żviluppati għall-kultura tat-tessuti. L-Fe₃O₄ għandu proprjetajiet manjetiċi sinifikanti, bijokompatibilità tajba, u l-abbiltà li jippromwovi t-tkabbir tal-pjanti u jnaqqas l-istress ambjentali, u għalhekk ġibed attenzjoni konsiderevoli fid-disinji tal-kultura tat-tessuti. L-applikazzjonijiet potenzjali ta' dawn in-nanopartiċelli jistgħu jinkludu l-ottimizzazzjoni tal-kultura in vitro biex jippromwovu d-diviżjoni taċ-ċelluli, itejbu l-assorbiment tan-nutrijenti, u jattivaw enzimi antiossidanti [11].
Għalkemm in-nanopartiċelli wrew effetti tajbin ta' promozzjoni tat-tkabbir tal-pjanti, studji dwar l-applikazzjoni kkombinata tan-nanopartiċelli Fe₃O₄ u regolaturi ottimizzati tat-tkabbir tal-pjanti f'*H. perforatum* għadhom skarsi. Biex jimtela dan il-vojt fl-għarfien, dan l-istudju evalwa l-effetti tal-effetti kkombinati tagħhom fuq il-morfoġenesi in vitro u l-produzzjoni ta' metaboliti sekondarji biex jipprovdi għarfien ġdid għat-titjib tal-karatteristiċi tal-pjanti mediċinali. Għalhekk, dan l-istudju għandu żewġ objettivi: (1) jottimizza l-konċentrazzjoni tar-regolaturi tat-tkabbir tal-pjanti biex jippromwovi b'mod effettiv il-formazzjoni tal-kallus, ir-riġenerazzjoni tar-rimjiet, u t-tnissil tal-għeruq in vitro; u (2) jevalwa l-effetti tan-nanopartiċelli Fe₃O₄ fuq il-parametri tat-tkabbir in vitro. Pjanijiet futuri jinkludu l-evalwazzjoni tar-rata ta' sopravivenza tal-pjanti riġenerati waqt l-akklimatizzazzjoni (in vitro). Huwa mistenni li r-riżultati ta' dan l-istudju jtejbu b'mod sinifikanti l-effiċjenza tal-mikropropagazzjoni ta' *H. perforatum*, u b'hekk jikkontribwixxu għall-użu sostenibbli u l-applikazzjonijiet bijoteknoloġiċi ta' din il-pjanta mediċinali importanti.
F'dan l-istudju, ksibna espjanti tal-weraq minn pjanti annwali tal-wort ta' San Ġwann imkabbra fl-għalqa (pjanti omm). Dawn l-espjanti ntużaw biex jottimizzaw il-kundizzjonijiet tal-kultura in vitro. Qabel il-kultivazzjoni, il-weraq tlaħalħu sewwa taħt ilma distillat ġieri għal diversi minuti. L-uċuħ tal-espjanti mbagħad ġew diżinfettati billi tgħaddsu f'70% etanol għal 30 sekonda, segwit minn immersjoni f'soluzzjoni ta' 1.5% sodium hypochlorite (NaOCl) li fiha ftit qtar ta' Tween 20 għal 10 minuti. Fl-aħħarnett, l-espjanti tlaħalħu tliet darbiet b'ilma distillat sterili qabel ma ttrasferixxew għall-mezz tal-kultura li jmiss.
Matul l-erba' ġimgħat ta' wara, tkejlu l-parametri tar-riġenerazzjoni tar-rimjiet, inkluż ir-rata ta' riġenerazzjoni, l-għadd ta' rimjiet għal kull espjant, u t-tul tar-rimjiet. Meta r-rimjiet riġenerati laħqu tul ta' mill-inqas 2 ċm, ġew trasferiti għal mezz ta' għeruq li kien jikkonsisti minn mezz MS ta' nofs is-saħħa, 0.5 mg/L aċidu indolebutyriku (IBA), u 0.3% gomma guar. Il-kultura tal-għeruq kompliet għal tliet ġimgħat, li matulhom tkejlu r-rata ta' għeruq, l-għadd ta' għeruq, u t-tul tal-għeruq. Kull trattament ġie ripetut tliet darbiet, b'10 espjanti kkultivati għal kull replika, li pproduċa madwar 30 espjant għal kull trattament.
L-għoli tal-pjanta tkejjel f'ċentimetri (ċm) bl-użu ta' riga, mill-bażi tal-pjanta sal-ponta tal-itwal werqa. It-tul tal-għerq tkejjel f'millimetri (mm) immedjatament wara li tneħħew bir-reqqa n-nebbieta u tneħħa l-mezz tat-tkabbir. L-għadd ta' blanzuni għal kull espjant ingħadd direttament fuq kull pjanta. L-għadd ta' tikek suwed fuq il-weraq, magħrufa bħala noduli, tkejjel viżwalment. Dawn in-noduli suwed huma maħsuba li huma glandoli li fihom iperiċina, jew tikek ossidattivi, u jintużaw bħala indikatur fiżjoloġiku tar-rispons tal-pjanta għat-trattament. Wara li tneħħa l-mezz tat-tkabbir kollu, il-piż frisk tan-nebbieta tkejjel bl-użu ta' skala elettronika b'eżattezza ta' milligrammi (mg).
Il-metodu għall-kalkolu tar-rata tal-formazzjoni tal-kallus huwa kif ġej: wara li jiġu kkultivati l-espjanti f'mezz li fih diversi regolaturi tat-tkabbir (kinasi, 2,4-D, u Fe3O4) għal erba' ġimgħat, jingħadd in-numru ta' espjanti kapaċi jiffurmaw kallus. Il-formula għall-kalkolu tar-rata tal-formazzjoni tal-kallus hija kif ġej:
Kull trattament ġie ripetut tliet darbiet, b'mill-inqas 10 espjanti eżaminati f'kull ripetizzjoni.
Ir-rata ta' riġenerazzjoni tirrifletti l-proporzjon tat-tessut tal-kallus li jlesti b'suċċess il-proċess ta' differenzjazzjoni tal-blanzuni wara l-istadju tal-formazzjoni tal-kallus. Dan l-indikatur juri l-abbiltà tat-tessut tal-kallus li jittrasforma f'tessut differenzjat u jikber f'organi ġodda tal-pjanti.
Il-koeffiċjent tal-għeruq huwa l-proporzjon tan-numru ta' friegħi kapaċi li jrabbu l-għeruq man-numru totali ta' friegħi. Dan l-indikatur jirrifletti s-suċċess tal-istadju tal-għeruq, li huwa kruċjali fil-mikropropagazzjoni u l-propagazzjoni tal-pjanti, peress li għeruq tajbin jgħinu lin-nebbieta jgħixu aħjar f'kundizzjonijiet ta' tkabbir.
Il-komposti tal-iperiċina ġew estratti b'90% metanol. Ħamsin mg ta' materjal tal-pjanti mnixxef ġie miżjud ma' 1 ml ta' metanol u sonikatu għal 20 minuta fi 30 kHz f'apparat tat-tindif ultrasoniku (mudell A5120-3YJ) f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Wara s-sonikazzjoni, il-kampjun ġie ċċentrifugat b'6000 rpm għal 15-il minuta. Is-supernatant inġabar, u l-assorbenza tal-iperiċina tkejlet f'592 nm bl-użu ta' spettrofotometru Plus-3000 S skont il-metodu deskritt minn Conceiçao et al. [14].
Il-biċċa l-kbira tat-trattamenti b'regolaturi tat-tkabbir tal-pjanti (PGRs) u nanopartiċelli tal-ossidu tal-ħadid (Fe₃O₄-NPs) ma kkawżawx formazzjoni ta' noduli suwed fuq il-weraq riġenerati tar-rimjiet. Ma ġew osservati l-ebda noduli f'xi wieħed mit-trattamenti b'0.5 jew 1 mg/L 2,4-D, 0.5 jew 1 mg/L kinetin, jew 1, 2, jew 4 mg/L nanopartiċelli tal-ossidu tal-ħadid. Ftit kombinazzjonijiet urew żieda żgħira fl-iżvilupp tan-noduli (iżda mhux statistikament sinifikanti) f'konċentrazzjonijiet ogħla ta' kinetin u/jew nanopartiċelli tal-ossidu tal-ħadid, bħall-kombinazzjoni ta' 2,4-D (0.5–2 mg/L) ma' kinetin (1–1.5 mg/L) u nanopartiċelli tal-ossidu tal-ħadid (2–4 mg/L). Dawn ir-riżultati huma murija fil-Figura 2. In-noduli suwed jirrappreżentaw glandoli rikki fl-iperiċina, kemm naturali kif ukoll ta' benefiċċju. F'dan l-istudju, in-noduli suwed kienu prinċipalment assoċjati mal-kannella tat-tessuti, li jindikaw ambjent favorevoli għall-akkumulazzjoni tal-iperiċina. It-trattament b'nanopartiċelli ta' 2,4-D, kinetin, u Fe₃O₄ ippromwova t-tkabbir tal-kallus, naqqas il-kannellar, u żied il-kontenut tal-klorofilla, li jissuġġerixxi funzjoni metabolika mtejba u tnaqqis potenzjali tal-ħsara ossidattiva [37]. Dan l-istudju evalwa l-effetti tal-kinetin flimkien ma' nanopartiċelli ta' 2,4-D u Fe₃O₄ fuq it-tkabbir u l-iżvilupp tal-kallus ta' St. John's wort (Fig. 3a–g). Studji preċedenti wrew li n-nanopartiċelli ta' Fe₃O₄ għandhom attivitajiet antifungali u antimikrobiċi [38, 39] u, meta jintużaw flimkien ma' regolaturi tat-tkabbir tal-pjanti, jistgħu jistimulaw mekkaniżmi ta' difiża tal-pjanti u jnaqqsu l-indiċi tal-istress ċellulari [18]. Għalkemm il-bijosintesi tal-metaboliti sekondarji hija regolata ġenetikament, ir-rendiment attwali tagħhom jiddependi ħafna fuq il-kundizzjonijiet ambjentali. Bidliet metaboliċi u morfoloġiċi jistgħu jinfluwenzaw il-livelli tal-metaboliti sekondarji billi jirregolaw l-espressjoni ta' ġeni speċifiċi tal-pjanti u jirrispondu għal fatturi ambjentali. Barra minn hekk, l-indutturi jistgħu jqanqlu l-attivazzjoni ta’ ġeni ġodda, li min-naħa tagħhom jistimulaw l-attività enżimatika, u fl-aħħar mill-aħħar jattivaw diversi mogħdijiet bijosintetiċi u jwasslu għall-formazzjoni ta’ metaboliti sekondarji. Barra minn hekk, studju ieħor wera li t-tnaqqis tad-dell iżid l-esponiment għax-xemx, u b’hekk iżid it-temperaturi matul il-jum fl-ħabitat naturali ta’ *Hypericum perforatum*, li jikkontribwixxi wkoll għal żieda fir-rendiment tal-ipericina. Abbażi ta’ din id-dejta, dan l-istudju investiga r-rwol tan-nanopartiċelli tal-ħadid bħala indutturi potenzjali fil-kultura tat-tessuti. Ir-riżultati wrew li dawn in-nanopartiċelli jistgħu jattivaw ġeni involuti fil-bijosintesi tal-esperidina permezz ta’ stimulazzjoni enżimatika, li twassal għal żieda fl-akkumulazzjoni ta’ dan il-kompost (Fig. 2). Għalhekk, meta mqabbla mal-pjanti li jikbru f’kundizzjonijiet naturali, jista’ jiġi argumentat li l-produzzjoni ta’ komposti bħal dawn in vivo tista’ wkoll tissaħħaħ meta stress moderat jiġi kkombinat mal-attivazzjoni ta’ ġeni involuti fil-bijosintesi ta’ metaboliti sekondarji. It-trattamenti kkombinati ġeneralment ikollhom effett pożittiv fuq ir-rata ta’ riġenerazzjoni, iżda f’xi każijiet, dan l-effett jiddgħajjef. Ta' min jinnota li t-trattament b'1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L kinase, u konċentrazzjonijiet differenti jistgħu jżidu b'mod indipendenti u sinifikanti r-rata ta' riġenerazzjoni b'50.85% meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll (Fig. 4c). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li kombinazzjonijiet speċifiċi ta' nanoormoni jistgħu jaġixxu b'mod sinerġistiku biex jippromwovu t-tkabbir tal-pjanti u l-produzzjoni tal-metaboliti, li huwa ta' sinifikat kbir għall-kultura tat-tessuti tal-pjanti mediċinali. Palmer u Keller [50] urew li t-trattament b'2,4-D jista' jikkaġuna b'mod indipendenti l-formazzjoni ta' kallus f'St. perforatum, filwaqt li ż-żieda ta' kinase tejbet b'mod sinifikanti l-formazzjoni u r-riġenerazzjoni ta' kallus. Dan l-effett kien dovut għat-titjib tal-bilanċ ormonali u l-istimulazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli. Bal et al. [51] sabu li t-trattament b'Fe₃O₄-NP jista' jtejjeb b'mod indipendenti l-funzjoni tal-enzimi antiossidanti, u b'hekk jippromwovi t-tkabbir tal-għeruq f'St. perforatum. Mezzi ta' kultura li fihom nanopartiċelli ta' Fe₃O₄ f'konċentrazzjonijiet ta' 0.5 mg/L, 1 mg/L, u 1.5 mg/L tejbu r-rata ta' riġenerazzjoni tal-pjanti tal-kittien [52]. L-użu ta' kinetin, 2,4-dichlorobenzothiazolinone, u nanopartiċelli ta' Fe₃O₄ tejjeb b'mod sinifikanti r-rati tal-formazzjoni tal-kallus u l-għeruq, madankollu, jeħtieġ li jiġu kkunsidrati l-effetti sekondarji potenzjali tal-użu ta' dawn l-ormoni għar-riġenerazzjoni in vitro. Pereżempju, l-użu fit-tul jew b'konċentrazzjoni għolja ta' 2,4-dichlorobenzothiazolinone jew kinetin jista' jirriżulta f'varjazzjoni klonali somatika, stress ossidattiv, morfoloġija anormali tal-kallus, jew vitrifikazzjoni. Għalhekk, rata għolja ta' riġenerazzjoni mhux bilfors tbassar l-istabbiltà ġenetika. Il-pjanti riġenerati kollha għandhom jiġu vvalutati bl-użu ta' markaturi molekulari (eż. RAPD, ISSR, AFLP) jew analiżi ċitoġenetika biex tiġi ddeterminata l-omoġeneità u x-xebh tagħhom mal-pjanti in vivo [53,54,55].
Dan l-istudju wera għall-ewwel darba li l-użu kkombinat ta' regolaturi tat-tkabbir tal-pjanti (2,4-D u kinetin) ma' nanopartiċelli Fe₃O₄ jista' jtejjeb il-morfoġenesi u l-akkumulazzjoni ta' metaboliti bijoattivi ewlenin (inklużi hypericin u hyperoside) f'*Hypericum perforatum*. Ir-reġim ta' trattament ottimizzat (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) mhux biss immassimizza l-formazzjoni tal-kallus, l-organoġenesi, u r-rendiment tal-metaboliti sekondarji iżda wera wkoll effett ħafif ta' induzzjoni, li potenzjalment itejjeb it-tolleranza għall-istress u l-valur mediċinali tal-pjanta. Il-kombinazzjoni tan-nanoteknoloġija u l-kultura tat-tessuti tal-pjanti tipprovdi pjattaforma sostenibbli u effiċjenti għall-produzzjoni in vitro fuq skala kbira ta' komposti mediċinali. Dawn ir-riżultati jwittu t-triq għal applikazzjonijiet industrijali u riċerka futura dwar mekkaniżmi molekulari, ottimizzazzjoni tad-dożaġġ u preċiżjoni ġenetika, u b'hekk jgħaqqdu r-riċerka fundamentali dwar pjanti mediċinali mal-bijoteknoloġija prattika.
Ħin tal-posta: 12 ta' Diċembru 2025