It-tkabbir tal-meristem apikali tar-rimja (SAM) huwa kritiku għall-arkitettura taz-zokk. Ormoni tal-pjantigiberellins(GAs) għandhom rwoli ewlenin fil-koordinazzjoni tat-tkabbir tal-pjanti, iżda r-rwol tagħhom fis-SAM għadu mhux mifhum. Hawnhekk, żviluppajna bijosensor proporzjonat tas-sinjalar GA billi nġiebu l-proteina DELLA biex irażżnu l-funzjoni regolatorja essenzjali tagħha fir-rispons traskrizzjoni GA filwaqt li ppreservaw id-degradazzjoni tagħha fuq ir-rikonoxximent tal-GA. Aħna nuru li dan il-bijosensur ibbażat fuq id-degradazzjoni jirreġistra b'mod preċiż il-bidliet fil-livelli tal-GA u s-sensing ċellulari matul l-iżvilupp. Aħna użajna dan il-biosensor biex nimmappaw l-attività tas-sinjalar tal-GA fis-SAM. Aħna nuru li s-sinjali GA għoljin huma preżenti b'mod predominanti f'ċelloli li jinsabu bejn primordi tal-organi, li huma prekursuri għaċ-ċelloli internode. Bl-użu ta 'approċċi ta' gwadann u telf ta 'funzjoni, aħna ulterjorment nuru li GA jirregola l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli, li jistabbilixxi l-organizzazzjoni ċellulari kanonika ta' internodes, u b'hekk jippromwovi l-ispeċifikazzjoni tal-internode fis-SAM.
Il-meristem apikali tar-rimja (SAM), li jinsab fil-quċċata tar-rimja, fih niċċa ta 'ċelloli staminali li l-attività tagħhom tiġġenera organi laterali u nodi staminali b'mod modulari u iterattiv tul il-ħajja tal-pjanta. Kull waħda minn dawn l-unitajiet ripetuti, jew nodi tal-pjanti, tinkludi internodes u organi laterali fin-nodi, u meristemi axillari fl-axils tal-weraq1. It-tkabbir u l-organizzazzjoni tan-nodi tal-pjanti jinbidlu matul l-iżvilupp. F'Arabidopsis, it-tkabbir internodali huwa mrażżan matul l-istadju veġetattiv, u meristemi axillari jibqgħu reqdin fl-axils tal-weraq tar-rosette. Matul it-tranżizzjoni għall-fażi tal-fjuri, is-SAM isir il-meristem tal-fjoritura, li jiġġenera internodes tawwali u blanzuni axillari, branchlets fl-axils tal-weraq cauline, u aktar tard, fjuri bla weraq2. Għalkemm għamilna progress sinifikanti fil-fehim tal-mekkaniżmi li jikkontrollaw il-bidu tal-weraq, il-fjuri u l-friegħi, relattivament ftit huwa magħruf dwar kif jinqalgħu l-internodes.
Il-fehim tad-distribuzzjoni spazjotemporali tal-GAs se jgħin biex jifhmu aħjar il-funzjonijiet ta 'dawn l-ormoni f'tessuti differenti u fi stadji ta' żvilupp differenti. Il-viżwalizzazzjoni tad-degradazzjoni tal-fużjoni RGA-GFP espressa taħt l-azzjoni tal-promotur tagħha stess tipprovdi informazzjoni importanti dwar ir-regolamentazzjoni tal-livelli totali ta 'GA fl-għeruq15,16. Madankollu, l-espressjoni RGA tvarja bejn it-tessuti17 u hija regolata minn GA18. Għalhekk, l-espressjoni differenzjali tal-promotur RGA tista 'tirriżulta fil-mudell tal-fluworexxenza osservat b'RGA-GFP u għalhekk dan il-metodu mhuwiex kwantitattiv. Aktar reċentement, GA19,20 bit-tikketta bijoattiva tal-fluorescein (Fl) żvelat l-akkumulazzjoni ta 'GA fl-endocortex ta' l-għeruq u r-regolazzjoni tal-livelli ċellulari tagħha permezz tat-trasport GA. Riċentement, is-sensor GA FRET nlsGPS1 wera li l-livelli ta 'GA jikkorrelataw mat-titwil taċ-ċelluli fl-għeruq, filamenti, u hypocotyls imkabbra fid-dlam21. Madankollu, kif rajna, il-konċentrazzjoni GA mhijiex l-uniku parametru li jikkontrolla l-attività ta 'sinjalazzjoni GA, peress li tiddependi fuq proċessi ta' sensing kumplessi. Hawnhekk, billi nibnu fuq il-fehim tagħna tal-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni DELLA u GA, nirrapportaw l-iżvilupp u l-karatterizzazzjoni ta' bijosensur proporzjonat ibbażat fuq id-degradazzjoni għas-sinjalar GA. Biex niżviluppaw dan il-biosensor kwantitattiv, użajna RGA mutant sensittiva għal GA li ġiet imwaqqfa ma 'proteina fluworexxenti u espressa kullimkien f'tessuti, kif ukoll proteina fluworexxenti insensittiva għal GA. Aħna nuru li l-fużjonijiet tal-proteini RGA mutanti ma jinterferixxux mas-sinjalar GA endoġenu meta espress kullimkien, u li dan il-biosensor jista 'jikkwantifika l-attività tas-sinjalar li tirriżulta kemm mill-input GA kif ukoll mill-ipproċessar tas-sinjali GA mill-apparat sensing b'riżoluzzjoni spazjotemporali għolja. Aħna użajna dan il-biosensor biex nimmappjaw id-distribuzzjoni spazjotemporali tal-attività tas-sinjalar tal-GA u nikkwantifikaw kif GA jirregola l-imġieba ċellulari fl-epidermide SAM. Aħna nuru li GA jirregola l-orjentazzjoni tal-pjan ta 'diviżjoni taċ-ċelloli SAM li jinsabu bejn primordiji tal-organi, u b'hekk tiddefinixxi l-organizzazzjoni ċellulari kanonika tal-internode.
Fl-aħħarnett, staqsejna jekk qmRGA jistax jirrapporta bidliet fil-livelli endoġeni ta 'GA bl-użu ta' hypocotyls li qed jikbru. Preċedentement urejna li n-nitrat jistimula t-tkabbir billi jżid is-sintesi tal-GA u, min-naħa tiegħu, id-degradazzjoni DELLA34. Għaldaqstant, osservajna li t-tul ta 'ipokotil f'nebbieta pUBQ10::qmRGA mkabbra taħt provvista abbundanti ta' nitrat (10 mM NO3-) kien itwal b'mod sinifikanti minn dak f'nebbieta mkabbra taħt kundizzjonijiet defiċjenti ta 'nitrat (Figura Supplimentari 6a). B'mod konsistenti mar-rispons tat-tkabbir, is-sinjali GA kienu ogħla f'ipokotili ta 'nebbieta mkabbra taħt kundizzjonijiet ta' 10 mM NO3- milli f'nebbieta mkabbra fin-nuqqas ta 'nitrat (Figura Supplimentari 6b, c). Għalhekk, qmRGA jippermetti wkoll il-monitoraġġ ta 'bidliet fis-sinjalar GA indotti minn bidliet endoġeni fil-konċentrazzjoni GA.
Biex nifhmu jekk l-attività tas-sinjalar GA misjuba minn qmRGA tiddependix fuq il-konċentrazzjoni GA u l-perċezzjoni GA, kif mistenni abbażi tad-disinn tas-sensorju, analizzajna l-espressjoni tat-tliet riċetturi GID1 fit-tessuti veġetattivi u riproduttivi. Fil-nebbieta, il-linja reporter GID1-GUS wriet li GID1a u c kienu espressi ħafna fil-kotiledoni (Fig. 3a-c). Barra minn hekk, it-tliet riċetturi kollha ġew espressi fil-weraq, primordija tal-għeruq laterali, ponot tal-għeruq (ħlief għall-għatu tal-għeruq ta 'GID1b), u s-sistema vaskulari (Fig. 3a-c). Fis-SAM tal-fjoritura, skoprejna sinjali GUS biss għal GID1b u 1c (Figura Supplimentari 7a-c). L-ibridizzazzjoni in situ kkonfermat dawn il-mudelli ta 'espressjoni u wriet aktar li GID1c kien espress b'mod uniformi f'livelli baxxi fis-SAM, filwaqt li GID1b wera espressjoni ogħla fil-periferija tas-SAM (Figura Supplimentari 7d-l). Il-fużjoni translazzjonali pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b żvelat ukoll firxa gradata ta 'espressjoni GID1b, minn espressjoni baxxa jew l-ebda espressjoni fiċ-ċentru tas-SAM għal espressjoni għolja fil-fruntieri tal-organi (Figura Supplimentari 7m). Għalhekk, ir-riċetturi GID1 mhumiex imqassma b'mod uniformi madwar u fi ħdan it-tessuti. F'esperimenti sussegwenti, osservajna wkoll li l-espressjoni żejda ta 'GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) żiedet is-sensittività ta' qmRGA f'ipokotili għal applikazzjoni esterna GA (Fig. 3d, e). B'kuntrast, il-fluworexxenza mkejla minn qd17mRGA fl-ipokotil kienet insensittiva għat-trattament GA3 (Fig. 3f, g). Għaż-żewġ analiżi, in-nebbieta ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet għoljin ta 'GA (100 μM GA3) biex tiġi vvalutata l-imġieba rapida tas-sensor, fejn il-kapaċità li torbot mar-riċettur GID1 ġiet imsaħħa jew mitlufa. Flimkien, dawn ir-riżultati jikkonfermaw li l-biosensor qmRGA jservi funzjoni magħquda bħala sensor GA u GA, u jissuġġerixxu li l-espressjoni differenzjali tar-riċettur GID1 tista 'timmodula b'mod sinifikanti l-emissività tas-sensor.
Sal-lum, id-distribuzzjoni tas-sinjali GA fis-SAM għadha mhux ċara. Għalhekk, użajna pjanti li jesprimu qmRGA u l-pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 biex nikkalkulaw mapep kwantitattivi b'riżoluzzjoni għolja ta 'attività ta' sinjalazzjoni GA, li tiffoka fuq is-saff L1 (epidermis; Fig. 4a, b, ara Metodi u Metodi Supplimentari), peress li l-kontroll L1 għandu rwol ewlieni fit-tkabbir SAM3. Hawnhekk, l-espressjoni pCLV3::mCherry-NLS ipprovdiet punt ta 'referenza ġeometrika fiss għall-analiżi tad-distribuzzjoni spazjotemporali tal-attività tas-sinjalar tal-GA37. Għalkemm GA hija kkunsidrata essenzjali għall-iżvilupp tal-organi laterali4, osservajna li s-sinjali GA kienu baxxi fil-primordium tal-fjuri (P) li jibdew mill-istadju P3 (Fig. 4a, b), filwaqt li primordiums żgħar P1 u P2 kellhom attività moderata simili għal dik fir-reġjun ċentrali (Fig. 4a, b). Attività ta 'sinjalazzjoni GA ogħla ġiet skoperta fil-konfini tal-primordju tal-organu, li tibda minn P1 / P2 (fil-ġnub tal-konfini) u laħqet il-quċċata f'P4, kif ukoll fiċ-ċelloli kollha tar-reġjun periferali li jinsab bejn il-primordi (Fig. 4a, b u Fig. Supplimentari 8a, b). Din l-attività ogħla ta 'sinjalazzjoni GA ġiet osservata mhux biss fl-epidermide iżda wkoll fis-saffi L2 u ta' fuq L3 (Fig. 8b Supplimentari). Il-mudell tas-sinjali GA misjuba fis-SAM bl-użu ta 'qmRGA wkoll baqa' ma nbidilx maż-żmien (Fig. Supplimentari 8c–f, k). Għalkemm il-kostruzzjoni qd17mRGA kienet sistematikament regolata 'l isfel fis-SAM ta' pjanti T3 minn ħames linji indipendenti li kkaratterizzajna fid-dettall, stajna nanalizzaw il-mudelli ta 'fluworexxenza miksuba bil-kostruzzjoni pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Figura Supplimentari 8g-j, l). F'din il-linja ta 'kontroll, bidliet żgħar biss fil-proporzjon tal-fluworexxenza ġew skoperti fis-SAM, iżda fiċ-ċentru SAM osservajna tnaqqis ċar u mhux mistenni fil-VENUS assoċjat ma' TagBFP. Dan jikkonferma li l-mudell tas-sinjalar osservat minn qmRGA jirrifletti degradazzjoni dipendenti fuq GA ta 'mRGA-VENUS, iżda juri wkoll li qmRGA jista' jistma żżejjed l-attività ta 'sinjalazzjoni GA fiċ-ċentru tal-meristem. Fil-qosor, ir-riżultati tagħna jiżvelaw mudell ta 'sinjalazzjoni GA li primarjament jirrifletti d-distribuzzjoni tal-primordija. Din id-distribuzzjoni tar-reġjun inter-primordijali (IPR) hija dovuta għall-istabbiliment gradwali ta 'attività ta' sinjalazzjoni GA għolja bejn il-primordju li qed jiżviluppa u r-reġjun ċentrali, filwaqt li fl-istess ħin l-attività ta 'sinjalazzjoni GA fil-primordju tonqos (Fig. 4c, d).
Id-distribuzzjoni tar-riċetturi GID1b u GID1c (ara hawn fuq) tissuġġerixxi li l-espressjoni differenzjali tar-riċetturi GA tgħin biex tifforma l-mudell tal-attività ta 'sinjalazzjoni GA fis-SAM. Staqsejna jekk tistax tkun involuta akkumulazzjoni differenzjali ta' GA. Biex ninvestigaw din il-possibbiltà, użajna nlsGPS1 GA FRET sensor21. Żieda fil-frekwenza ta 'attivazzjoni ġiet skoperta fis-SAM ta' nlsGPS1 ittrattat b'10 μM GA4 + 7 għal 100 min (Figura Supplimentari 9a–e), li jindika li nlsGPS1 jirrispondi għal bidliet fil-konċentrazzjoni GA fis-SAM, kif jagħmel fl-għeruq21. Id-distribuzzjoni spazjali tal-frekwenza ta 'attivazzjoni nlsGPS1 żvelat livelli ta' GA relattivament baxxi fis-saffi ta 'barra tas-SAM, iżda wrew li kienu elevati fiċ-ċentru u fil-fruntieri tas-SAM (Fig. 4e u Fig. Supplimentari 9a, c). Dan jissuġġerixxi li GA hija distribwita wkoll fis-SAM b'mudell spazjali komparabbli ma 'dak żvelat minn qmRGA. Bħala approċċ komplementari, ittrattajna wkoll is-SAM b'GA fluworexxenti (GA3-, GA4-, GA7-Fl) jew Fl biss bħala kontroll negattiv. Is-sinjal Fl kien imqassam matul is-SAM, inkluż ir-reġjun ċentrali u l-primordju, għalkemm b'intensità aktar baxxa (Fig. 4j u Supplimentari Fig. 10d). B'kuntrast, it-tliet GA-Fl akkumulaw speċifikament fi ħdan il-fruntieri tal-primordium u fi gradi differenti fil-bqija tal-IPR, b'GA7-Fl jakkumula fl-akbar dominju fl-IPR (Fig. 4k u Supplimentari Fig. 10a, b). Il-kwantifikazzjoni tal-intensità tal-fluworexxenza wriet li l-proporzjon tal-intensità tal-IPR għal mhux tal-IPR kien ogħla f'SAM ittrattat b'GA-Fl meta mqabbel ma 'SAM ittrattat b'Fl (Fig. 4l u Fig. Supplimentari 10c). Flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li GA hija preżenti f'konċentrazzjonijiet ogħla fiċ-ċelloli IPR li jinsabu l-eqreb tal-fruntiera tal-organu. Dan jissuġġerixxi li l-mudell tal-attività ta 'sinjalazzjoni SAM GA jirriżulta kemm minn espressjoni differenzjali ta' riċetturi GA kif ukoll akkumulazzjoni differenzjali ta 'GA fiċ-ċelloli IPR ħdejn il-fruntieri tal-organi. Għalhekk, l-analiżi tagħna wriet mudell spazjotemporali mhux mistenni ta 'sinjalazzjoni GA, b'attività aktar baxxa fiċ-ċentru u primordju tas-SAM u attività ogħla fl-IPR fir-reġjun periferali.
Biex nifhmu r-rwol ta 'attività differenzjali ta' sinjalazzjoni GA fis-SAM, analizzajna l-korrelazzjoni bejn l-attività ta 'sinjalazzjoni GA, l-espansjoni taċ-ċelluli u d-diviżjoni taċ-ċelluli bl-użu ta' immaġini ta 'time-lapse f'ħin reali tas-SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Minħabba r-rwol tal-GA fir-regolazzjoni tat-tkabbir, kienet mistennija korrelazzjoni pożittiva mal-parametri tal-espansjoni taċ-ċelluli. Għalhekk, l-ewwel qabbilna mapep ta 'attività ta' sinjalazzjoni GA ma 'mapep tar-rata ta' tkabbir tal-wiċċ taċ-ċelluli (bħala prokura għas-saħħa tal-espansjoni taċ-ċelluli għal ċellula partikolari u għal ċelluli bint fid-diviżjoni) u ma 'mapep ta' anisotropija tat-tkabbir, li tkejjel id-direzzjonalità tal-espansjoni taċ-ċelluli (użata wkoll hawn għal ċellula partikolari u għal ċelluli bint fid-diviżjoni; Fig. 5a, b, ara Metodi u Supplimenti). Il-mapep tagħna tar-rata tat-tkabbir tal-wiċċ taċ-ċelluli SAM huma konsistenti ma 'osservazzjonijiet preċedenti38,39, b'rati ta' tkabbir minimi fil-fruntiera u rati ta 'tkabbir massimi fl-iżvilupp tal-fjuri (Fig. 5a). L-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) wriet li l-attività tas-sinjalar tal-GA kienet korrelatata b'mod negattiv mal-intensità tat-tkabbir tal-wiċċ taċ-ċellula (Figura 5c). Aħna wrejna wkoll li l-assi ewlenin tal-varjazzjoni, inkluż l-input tas-sinjalar GA u l-intensità tat-tkabbir, kienu ortogonali għad-direzzjoni determinata minn espressjoni għolja CLV3, li tikkonferma l-esklużjoni taċ-ċelloli miċ-ċentru SAM fl-analiżi li fadal. L-analiżi ta 'korrelazzjoni ta' Spearman ikkonfermat ir-riżultati tal-PCA (Figura 5d), li tindika li sinjali GA ogħla fl-IPR ma rriżultawx f'espansjoni ogħla taċ-ċelluli. Madankollu, l-analiżi tal-korrelazzjoni wriet korrelazzjoni kemmxejn pożittiva bejn l-attività tas-sinjalar tal-GA u l-anisotropija tat-tkabbir (Figura 5c, d), li tissuġġerixxi li sinjalazzjoni GA ogħla fl-IPR tinfluwenza d-direzzjoni tat-tkabbir taċ-ċelluli u possibbilment il-pożizzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli.
a, b Mapep tas-sħana ta 'tkabbir medju tal-wiċċ (a) u anisotropija tat-tkabbir (b) f'SAM medja fuq seba' pjanti indipendenti (użati bħala prokuri għas-saħħa u d-direzzjoni tal-espansjoni taċ-ċelluli, rispettivament). c Analiżi PCA inkludiet il-varjabbli li ġejjin: sinjal GA, intensità tat-tkabbir tal-wiċċ, anisotropija tat-tkabbir tal-wiċċ, u espressjoni CLV3. Il-komponent 1 tal-PCA kien prinċipalment korrelatat b'mod negattiv mal-intensità tat-tkabbir tal-wiċċ u kkorrelata b'mod pożittiv mas-sinjal GA. Il-komponent 2 tal-PCA kien prinċipalment korrelatat b'mod pożittiv mal-aniżotropija tat-tkabbir tal-wiċċ u korrelata b'mod negattiv mal-espressjoni CLV3. Il-perċentwali jirrappreżentaw il-varjazzjoni spjegata minn kull komponent. d Analiżi ta' korrelazzjoni Spearman bejn is-sinjal GA, l-intensità tat-tkabbir tal-wiċċ, u l-aniżotropija tat-tkabbir tal-wiċċ fuq l-iskala tat-tessut eskluż CZ. In-numru fuq il-lemin huwa l-valur rho ta' Spearman bejn żewġ varjabbli. L-asterisks jindikaw każijiet fejn il-korrelazzjoni/korrelazzjoni negattiva hija sinifikanti ħafna. e Viżwalizzazzjoni 3D ta' ċelloli Col-0 SAM L1 permezz ta' mikroskopija konfokali. Ħitan taċ-ċelluli ġodda ffurmati fis-SAM (iżda mhux il-primordium) f'10 h huma kkuluriti skont il-valuri tal-angoli tagħhom. Il-bar tal-kulur tidher fir-rokna t'isfel tal-lemin. Id-daħla turi l-immaġni 3D korrispondenti f'0 h. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. f Kaxxi plottijiet juru rati ta 'diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR u mhux IPR Col-0 SAM (n = 10 pjanti indipendenti). Il-linja taċ-ċentru turi l-medjan, u l-konfini tal-kaxxa jindikaw il-25 u l-75 perċentili. Il-whiskers jindikaw il-valuri minimi u massimi determinati bis-softwer R. Il-valuri P inkisbu bit-test t b'żewġ denbu ta' Welch. g, h Dijagramma skematika li turi (g) kif tkejjel l-angolu tal-ħajt taċ-ċellula l-ġdid (maġenta) fir-rigward tad-direzzjoni radjali miċ-ċentru tas-SAM (linja bit-tikek bajda) (il-valuri ta 'angolu akut biss, jiġifieri, 0-90 °, huma kkunsidrati), u (h) id-direzzjonijiet ċirkonferenzjali/laterali u radjali fi ħdan il-meristem. i Istogrammi tal-frekwenza tal-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli tul is-SAM (blu skur), IPR (blu medju), u mhux IPR (blu ċar), rispettivament. Il-valuri P inkisbu permezz ta' test Kolmogorov-Smirnov b'żewġ denbu. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. j Istogrammi tal-frekwenza tal-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli tal-IPR madwar P3 (aħdar ċar), P4 (aħdar medju), u P5 (aħdar skur), rispettivament. Il-valuri P inkisbu permezz ta' test Kolmogorov-Smirnov b'żewġ denbu. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili.
Għalhekk, imbagħad investigajna l-korrelazzjoni bejn is-sinjalar GA u l-attività tad-diviżjoni taċ-ċelluli billi nidentifikaw ħitan taċ-ċelluli ffurmati ġodda matul l-assaġġ (Fig. 5e). Dan l-approċċ ippermetta li nkejlu l-frekwenza u d-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli. B'mod sorprendenti, sibna li l-frekwenza tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fl-IPR u l-bqija tas-SAM (mhux IPR, Fig. 5f) kienet simili, u tindika li d-differenzi fis-sinjalar GA bejn iċ-ċelloli IPR u mhux IPR ma jaffettwawx b'mod sinifikanti d-diviżjoni taċ-ċelluli. Dan, u l-korrelazzjoni pożittiva bejn is-sinjalar GA u l-anisotropija tat-tkabbir, wassluna biex nikkunsidraw jekk l-attività ta 'sinjalazzjoni GA tistax tinfluwenza l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli. Aħna kejlu l-orjentazzjoni tal-ħajt taċ-ċellula l-ġdid bħala angolu akut relattiv għall-assi radjali li jgħaqqad iċ-ċentru tal-meristem u ċ-ċentru tal-ħajt taċ-ċellula l-ġdid (Fig. 5e-i) u osservajna tendenza ċara għaċ-ċelloli li jaqsmu f'angoli qrib 90 ° relattiv għall-assi radjali, bl-ogħla frekwenzi osservati f'70-80 ° 28 %) (2 30-28 %) (2 . (Fig. 5e, i), li jikkorrispondi għad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fid-direzzjoni ċirkonferenzjali/trasversali (Fig. 5h). Biex teżamina l-kontribut tas-sinjalar GA għal din l-imġieba tad-diviżjoni taċ-ċelluli, analiznajna l-parametri tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR u mhux IPR separatament (Fig. 5i). Aħna osservajna li d-distribuzzjoni tal-angolu tad-diviżjoni fiċ-ċelloli IPR kienet differenti minn dik f'ċelloli mhux IPR jew f'ċelloli fis-SAM kollu, b'ċelloli IPR li juru proporzjon ogħla ta 'diviżjonijiet taċ-ċelluli laterali/ċirkolari, jiġifieri, 70-80 ° u 80-90 ° (33.86% u 30.71%, rispettivament, proporzjonijiet korrispondenti (Fig. 5)i). Għalhekk, l-osservazzjonijiet tagħna wrew assoċjazzjoni bejn sinjalazzjoni GA għolja u orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli qrib id-direzzjoni ċirkonferenzjali, simili għall-korrelazzjoni bejn l-attività ta 'sinjalazzjoni GA u l-anisotropija tat-tkabbir (Fig. 5c, d). Biex nistabbilixxu aktar il-konservazzjoni spazjali ta 'din l-assoċjazzjoni, aħna kejlu l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni fiċ-ċelloli IPR madwar il-primordju li jibda minn P3, peress li l-ogħla attività ta' sinjalazzjoni GA ġiet skoperta f'dan ir-reġjun li jibda minn P4 (Fig. 4). L-angoli tad-diviżjoni tal-IPR madwar P3 u P4 ma wrew l-ebda differenzi statistikament sinifikanti, għalkemm ġiet osservata frekwenza akbar ta 'diviżjonijiet laterali taċ-ċelluli fl-IPR madwar P4 (Fig. 5j). Madankollu, fiċ-ċelloli IPR madwar P5, id-differenza fl-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli saret statistikament sinifikanti, b'żieda qawwija fil-frekwenza tad-diviżjonijiet trasversali taċ-ċelluli (Fig. 5j). Flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li s-sinjalar GA jista 'jikkontrolla l-orjentazzjoni tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fis-SAM, li huwa konsistenti mar-rapporti preċedenti40,41 li sinjalar GA għoli jista' jinduċi orjentazzjoni laterali tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fl-IPR.
Huwa mbassar li ċ-ċelloli fl-IPR mhux se jiġu inkorporati fil-primordiji iżda pjuttost fl-internodes2,42,43. L-orjentazzjoni trasversali tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fl-IPR tista 'tirriżulta fl-organizzazzjoni tipika ta' ringieli lonġitudinali paralleli ta 'ċelluli epidermali f'internodes. L-osservazzjonijiet tagħna deskritti hawn fuq jissuġġerixxu li s-sinjalar GA x'aktarx għandu rwol f'dan il-proċess billi jirregola d-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli.
Telf tal-funzjoni ta 'diversi ġeni DELLA jirriżulta f'rispons GA kostituttiv, u mutanti della jistgħu jintużaw biex tittestja din l-ipoteżi44. L-ewwel analizzajna l-mudelli ta 'espressjoni ta' ħames ġeni DELLA fis-SAM. Il-fużjoni traskrizzjonali tal-linja GUS45 żvelat li GAI, RGA, RGL1, u RGL2 (sa punt ferm inqas) ġew espressi fis-SAM (Figura Supplimentari 11a–d). L-ibridizzazzjoni in situ wriet aktar li l-mRNA tal-GAI jakkumula speċifikament fil-primordiji u l-fjuri li qed jiżviluppaw (Fig. 11e Supplimentari). RGL1 u RGL3 mRNA ġew skoperti matul il-kanupew SAM u fi fjuri anzjani, filwaqt li RGL2 mRNA kien aktar abbundanti fir-reġjun tal-fruntiera (Figura Supplimentari 11f-h). Immaġini konfokali ta 'pRGL3::RGL3-GFP SAM ikkonfermat l-espressjoni osservata permezz ta' ibridizzazzjoni in situ u wriet li l-proteina RGL3 takkumula fil-parti ċentrali tas-SAM (Figura Supplimentari 11i). Bl-użu tal-linja pRGA::GFP-RGA, sibna wkoll li l-proteina RGA takkumula fis-SAM, iżda l-abbundanza tagħha tonqos fil-fruntiera li tibda minn P4 (Figura Supplimentari 11j). Notevolment, il-mudelli ta 'espressjoni ta' RGL3 u RGA huma konsistenti ma 'attività ta' sinjalazzjoni GA ogħla fl-IPR, kif misjuba minn qmRGA (Fig. 4). Barra minn hekk, din id-dejta tindika li d-DELLAs kollha huma espressi fis-SAM u li l-espressjoni tagħhom kollettivament tinfirex mas-SAM kollu.
Imbagħad analizzajna l-parametri tad-diviżjoni taċ-ċelluli fil-SAM tat-tip selvaġġ (Ler, kontroll) u l-gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 tal-quintuple (globali) mutanti (Fig. 6a, b). Interessanti, osservajna bidla statistikament sinifikanti fid-distribuzzjoni tal-frekwenzi tal-angolu tad-diviżjoni taċ-ċelluli fil-SAM mutant globali della meta mqabbel mat-tip selvaġġ (Fig. 6c). Din il-bidla fid-della global mutant kienet dovuta għal żieda fil-frekwenza ta 'angoli ta' 80-90 ° (34.71% vs 24.55%) u, sa ċertu punt, angoli ta '70-80 ° (23.78% vs 20.18%), jiġifieri, li jikkorrispondu għal diviżjonijiet trasversali taċ-ċelluli (Fig. 6c). Il-frekwenza ta 'diviżjonijiet mhux trasversali (0-60 °) kienet ukoll aktar baxxa fil-mutant globali della (Fig. 6c). Il-frekwenza tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli trasversali żdiedet b'mod sinifikanti fis-SAM tal-mutant globali della (Fig. 6b). Il-frekwenza tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli trasversali fl-IPR kienet ukoll ogħla fid-della mutant globali meta mqabbla mat-tip selvaġġ (Fig. 6d). Barra mir-reġjun tal-IPR, it-tip selvaġġ kellu distribuzzjoni aktar uniformi tal-angoli tad-diviżjoni taċ-ċelluli, filwaqt li l-mutant globali tad-diviżjonijiet tanġenzjali pprefera bħall-IPR (Fig. 6e). Aħna kkwantifikajna wkoll l-orjentazzjoni tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fis-SAM ta 'mutanti quintuple ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, u ga2ox6-2), sfond mutant GA-inattiv li fih jakkumula GA. B'mod konsistenti maż-żieda fil-livelli GA, is-SAM tal-fjoritura mutant ga2ox quintuple kienet akbar minn dik ta 'Col-0 (Fig. Supplimentari 12a, b), u meta mqabbla ma' Col-0, il-sAM quintuple ga2ox wera distribuzzjoni distintament differenti ta 'angoli ta' diviżjoni taċ-ċelluli, bil-frekwenza tal-angolu tiżdied minn 50 °, diviżjoni tanġenzjali għal darb'oħra favur diviżjoni 90 °, pp. Fig. 12a–c). Għalhekk, nuru li l-attivazzjoni kostituttiva tas-sinjalar GA u l-akkumulazzjoni tal-GA jinduċu diviżjonijiet taċ-ċelluli laterali fl-IPR u l-bqija tas-SAM.
a, b Viżwalizzazzjoni 3D tas-saff L1 ta 'Ler (a) u mutant globali (b) SAM bl-użu ta' mikroskopija konfokali. Ħitan taċ-ċelluli ġodda ffurmati fis-SAM (iżda mhux il-primordium) fuq perjodu ta '10-h huma murija u kkulurita skond il-valuri ta' l-angoli tagħhom. Id-daħla turi s-SAM f'0 h. Il-bar tal-kulur hija murija fir-rokna t'isfel tal-lemin. Il-vleġġa f'(b) tipponta lejn eżempju ta' fajls taċ-ċelluli allinjati fil-mutant globali della. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. paragun ce tad-distribuzzjoni tal-frekwenza tal-orjentazzjonijiet tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fis-SAM kollu (d), IPR (e), u mhux IPR (f) bejn Ler u globali della. Il-valuri P inkisbu permezz ta' test Kolmogorov-Smirnov b'żewġ denbu. f, g Viżwalizzazzjoni 3D ta 'immaġini konfokali ta' SAM imtebba 'PI ta' pjanti transġeniċi Col-0 (i) u pCUC2::gai-1-VENUS (j). Pannelli (a, b) juru ħitan taċ-ċelluli ġodda (iżda mhux primordia) iffurmati fis-SAM fi żmien 10 h. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. h–j Tqabbil tad-distribuzzjoni tal-frekwenza tal-orjentazzjonijiet tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli li jinsabu fis-SAM kollha (h), IPR (i) u mhux IPR (j) bejn pjanti Col-0 u pCUC2::gai-1-VENUS. Il-valuri P inkisbu permezz ta’ test Kolmogorov–Smirnov b’żewġ denbu.
Wara ttestjajna l-effett tal-inibizzjoni tas-sinjalar GA speċifikament fl-IPR. Għal dan il-għan, użajna l-promotur tal-cotyledon cup 2 (CUC2) biex issuq l-espressjoni ta 'proteina gai-1 negattiv dominanti mgħaqqda ma' VENUS (fil-linja pCUC2::gai-1-VENUS). Fis-SAM tat-tip selvaġġ, il-promotur CUC2 imexxi l-espressjoni tal-biċċa l-kbira tal-IPRs fis-SAM, inklużi ċ-ċelloli tal-fruntiera, minn P4 'il quddiem, u espressjoni speċifika simili kienet osservata fil-pjanti pCUC2::gai-1-VENUS (ara hawn taħt). Id-distribuzzjoni tal-angoli tad-diviżjoni taċ-ċelluli madwar is-SAM jew l-IPR tal-pjanti pCUC2::gai-1-VENUS ma kinitx differenti b'mod sinifikanti minn dik tat-tip selvaġġ, għalkemm b'mod mhux mistenni sibna li ċ-ċelloli mingħajr IPR f'dawn l-impjanti maqsuma bi frekwenza ogħla ta '80-90 ° (Fig. 6f-j).
Ġie ssuġġerit li d-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli tiddependi fuq il-ġeometrija tas-SAM, b'mod partikolari l-istress tensili ġġenerat mill-kurvatura tat-tessut46. Għalhekk staqsejna jekk il-forma tas-SAM ġietx mibdula fil-pjanti mutanti globali u pCUC2::gai-1-VENUS. Kif irrappurtat qabel12, id-daqs tal-SAM mutant globali della kien akbar minn dak tat-tip selvaġġ (Fig. Supplimentari 13a, b, d). L-ibridizzazzjoni in situ ta 'CLV3 u STM RNA kkonfermat l-espansjoni tal-meristem f'della mutanti u wriet aktar l-espansjoni laterali tan-niċċa taċ-ċelluli staminali (Fig. Supplimentari 13e, f, h, i). Madankollu, il-kurvatura SAM kienet simili fiż-żewġ ġenotipi (Figura Supplimentari 13k, m, n, p). Aħna osservajna żieda simili fid-daqs fil-gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant mingħajr bidla fil-kurvatura meta mqabbla mat-tip selvaġġ (Figura Supplimentari 13c, d, g, j, l, o, p). Il-frekwenza tal-orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli kienet affettwata wkoll fil-mutant quadruple della, iżda sa ċertu punt inqas milli fil-mutant monolitiku della (Fig. Supplimentari 12d-f). Dan l-effett tad-dożaġġ, flimkien man-nuqqas ta 'effett fuq il-kurvatura, jissuġġerixxi li l-attività RGL3 residwa fil-mutant quadruple Della tillimita bidliet fl-orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli kkawżati minn telf ta' attività DELLA u li bidliet fid-diviżjonijiet laterali taċ-ċelluli jseħħu b'reazzjoni għal bidliet fl-attività ta 'sinjalazzjoni GA aktar milli bidliet fil-ġeometrija SAM. Kif deskritt hawn fuq, il-promotur CUC2 imexxi l-espressjoni tal-IPR fis-SAM li jibda minn P4 (Figura Supplimentari 14a, b), u b'kuntrast, il-pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM kellu daqs imnaqqas iżda kurvatura ogħla (Fig. Supplimentari 14c–h). Din il-bidla fil-morfoloġija pCUC2::gai-1-VENUS SAM tista 'tirriżulta f'distribuzzjoni differenti ta' tensjonijiet mekkaniċi meta mqabbla mat-tip selvaġġ, li fih tensjonijiet ċirkonferenzjali għolja jibdew f'distanza iqsar miċ-ċentru SAM47. Alternattivament, il-bidliet fil-morfoloġija pCUC2::gai-1-VENUS SAM jistgħu jirriżultaw minn bidliet fil-proprjetajiet mekkaniċi reġjonali indotti mill-espressjoni transġene48. Fiż-żewġ każijiet, dan jista 'jikkumpensa parzjalment l-effetti tal-bidliet fis-sinjalar GA billi żżid il-probabbiltà li ċ-ċelloli jinqasmu fl-orjentazzjoni ċirkonferenzjali/trasversali, u jispjega l-osservazzjonijiet tagħna.
Meħuda flimkien, id-dejta tagħna tikkonferma li s-sinjalar GA ogħla għandu rwol attiv fl-orjentazzjoni laterali tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR. Huma juru wkoll li l-kurvatura tal-meristem tinfluwenza wkoll l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR.
L-orjentazzjoni trasversali tal-pjan ta 'diviżjoni fl-IPR, minħabba attività ta' sinjalar GA għolja, tissuġġerixxi li GA torganizza minn qabel fajl taċ-ċelluli radjali fl-epidermide fi ħdan is-SAM biex tiddefinixxi l-organizzazzjoni ċellulari li aktar tard tinstab fl-internode epidermali. Tabilħaqq, tali fajls taċ-ċelluli kienu viżibbli ta 'spiss fl-immaġini SAM ta' mutanti globali (Fig. 6b). Għalhekk, biex tesplora aktar il-funzjoni ta 'żvilupp tal-mudell spazjali ta' sinjalazzjoni GA fil-SAM, użajna immaġini time-lapse biex tanalizza l-organizzazzjoni spazjali ta 'ċelloli fl-IPR f'tip selvaġġ (Ler u Col-0), mutanti globali, u pCUC2::gai-1-VENUS pjanti transġeniċi.
Sibna li qmRGA wera li l-attività ta 'sinjalazzjoni GA fl-IPR żdiedet minn P1 / P2 u laħqet il-quċċata f'P4, u dan ix-xejra baqa' kostanti maż-żmien (Fig. 4a-f u Supplimentari Fig. 8c-f, k). Biex tanalizza l-organizzazzjoni spazjali taċ-ċelloli fl-IPR b'sinjal GA li qed jiżdied, aħna ttikkettjaw ċelluli Ler IPR fuq u mal-ġnub ta 'P4 skond id-destin ta' żvilupp tagħhom analizzat 34 siegħa wara l-ewwel osservazzjoni, jiġifieri, aktar minn żewġ darbiet plastid, li jippermettilna nsegwu ċelloli IPR matul l-iżvilupp tal-primordju minn P1 / P2 sa P4. Aħna użajna tliet kuluri differenti: isfar għal dawk iċ-ċelloli li kienu integrati fil-primordium ħdejn P4, aħdar għal dawk li kienu fl-IPR, u vjola għal dawk li pparteċipaw fiż-żewġ proċessi (Fig. 7a-c). F't0 (0 h), 1-2 saffi ta 'ċelloli IPR kienu viżibbli quddiem P4 (Fig. 7a). Kif mistenni, meta dawn iċ-ċelloli qasmu, għamlu dan prinċipalment permezz tal-pjan ta 'diviżjoni trasversali (Figuri 7a-c). Riżultati simili nkisbu bl-użu ta 'Col-0 SAM (li jiffokaw fuq P3, li l-bord tiegħu jingħalaq b'mod simili għal P4 f'Ler), għalkemm f'dan il-ġenotip it-tinja ffurmata fil-fruntiera tal-fjuri ħeba ċ-ċelloli IPR aktar malajr (Fig. 7g-i). Għalhekk, il-mudell tad-diviżjoni taċ-ċelloli IPR jorganizza minn qabel iċ-ċelloli f'ringieli radjali, bħal f'internodes. L-organizzazzjoni ta 'ringieli radjali u l-lokalizzazzjoni ta' ċelloli IPR bejn organi suċċessivi jissuġġerixxu li dawn iċ-ċelloli huma proġenituri internodali.
Hawnhekk, żviluppajna biosensor ta 'sinjalar GA proporzjonat, qmRGA, li jippermetti mapping kwantitattiv ta' attività ta 'sinjalazzjoni GA li tirriżulta minn konċentrazzjonijiet ta' riċetturi GA u GA magħquda filwaqt li timminimizza l-interferenza ma 'mogħdijiet ta' sinjalazzjoni endoġeni, u b'hekk tipprovdi informazzjoni dwar il-funzjoni GA fil-livell ċellulari. Għal dan il-għan, bnejna proteina DELLA modifikata, mRGA, li tilfet il-kapaċità li torbot l-imsieħba ta 'interazzjoni DELLA iżda tibqa' sensittiva għall-proteolysis indotta minn GA. qmRGA jirrispondi kemm għal bidliet eżoġeni kif ukoll endoġeni fil-livelli GA, u l-proprjetajiet dinamiċi ta 'sensing tiegħu jippermettu valutazzjoni ta' bidliet spazjotemporali fl-attività ta 'sinjalazzjoni GA matul l-iżvilupp. qmRGA huwa wkoll għodda flessibbli ħafna peress li jista 'jiġi adattat għal tessuti differenti billi jinbidel il-promotur użat għall-espressjoni tiegħu (jekk meħtieġ), u minħabba n-natura kkonservata tal-mogħdija tas-sinjalar GA u l-motif PFYRE madwar angiosperms, x'aktarx li jkun trasferibbli għal speċi oħra22. B'mod konsistenti ma 'dan, intweriet ukoll mutazzjoni ekwivalenti fil-proteina DELLA tar-ross SLR1 (HYY497AAA) li trażżan l-attività repressuri tat-tkabbir ta' SLR1 filwaqt li tnaqqas biss ftit id-degradazzjoni tagħha medjata minn GA, simili għal mRGA23. Notevolment, studji reċenti f'Arabidopsis wrew li mutazzjoni waħda ta 'aċidu amminiku fid-dominju PFYRE (S474L) bidlet l-attività ta' traskrizzjoni ta 'RGA mingħajr ma taffettwa l-kapaċità tagħha li jinteraġixxi ma' sħab tal-fattur ta 'traskrizzjoni50. Għalkemm din il-mutazzjoni hija qrib ħafna tat-3 sostituzzjonijiet ta 'aċidi amminiċi preżenti fl-mRGA, l-istudji tagħna juru li dawn iż-żewġ mutazzjonijiet ibiddlu karatteristiċi distinti ta' DELLA. Għalkemm il-biċċa l-kbira tal-imsieħba tal-fattur ta 'traskrizzjoni jorbtu mad-dominji LHR1 u SAW ta' DELLA26,51, xi aċidi amminiċi kkonservati fid-dominju PFYRE jistgħu jgħinu biex jistabbilizzaw dawn l-interazzjonijiet.
L-iżvilupp tal-internode huwa karatteristika ewlenija fl-arkitettura tal-pjanti u t-titjib tar-rendiment. qmRGA żvela attività ogħla ta 'sinjalazzjoni GA fiċ-ċelloli proġenitriċi ta' internode IPR. Billi għaqqad immaġini kwantitattivi u ġenetika, urejna li l-mudelli ta 'sinjalazzjoni GA jissuperponu pjani ta' diviżjoni taċ-ċelluli ċirkolari/trasversali fl-epidermide SAM, iffurmaw l-organizzazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli meħtieġa għall-iżvilupp internode. Diversi regolaturi tal-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli ġew identifikati matul l-iżvilupp52,53. Ix-xogħol tagħna jipprovdi eżempju ċar ta 'kif l-attività tas-sinjalar GA tirregola dan il-parametru ċellulari. DELLA tista 'tinteraġixxi ma' kumplessi ta 'proteini li jintwew minn qabel41, għalhekk is-sinjalar GA jista' jirregola l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli billi jinfluwenza direttament l-orjentazzjoni tal-mikrotubuli kortikali40,41,54,55. Aħna urejna bla mistenni li f'SAM, il-korrelazzjoni ta 'attività ta' sinjalazzjoni GA ogħla ma kinitx it-titwil jew id-diviżjoni taċ-ċelluli, iżda biss l-anisotropija tat-tkabbir, li hija konsistenti ma 'effett dirett ta' GA fuq id-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR. Madankollu, ma nistgħux neskludu li dan l-effett jista 'jkun indirett ukoll, pereżempju medjat minn trattib tal-ħajt taċ-ċelluli indott minn GA56. Bidliet fil-proprjetajiet tal-ħajt taċ-ċelluli jinduċu stress mekkaniku57,58, li jista 'wkoll jinfluwenza l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli billi jaffettwa l-orjentazzjoni tal-mikrotubuli kortikali39,46,59. L-effetti magħquda ta 'stress mekkaniku indott minn GA u regolazzjoni diretta ta' orjentazzjoni tal-mikrotubuli minn GA jistgħu jkunu involuti fil-ġenerazzjoni ta 'mudell speċifiku ta' orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR biex jiddefinixxu internodes, u aktar studji huma meħtieġa biex tittestja din l-idea. Bl-istess mod, studji preċedenti enfasizzaw l-importanza tal-proteini li jinteraġixxu DELLA TCP14 u 15 fil-kontroll tal-formazzjoni tal-internode60,61 u dawn il-fatturi jistgħu jimmedjaw l-azzjoni ta 'GA flimkien ma' BREVIPEDICELLUS (BP) u PENNYWISE (PNY), li jirregolaw l-iżvilupp tal-internode u wrew li jinfluwenzaw is-sinjalar tal-GA2,62. Minħabba li DELLAs jinteraġixxu ma 'mogħdijiet ta' sinjalar ta 'brassinosterojdi, etilene, aċidu jasmonic u aċidu abscisic (ABA)63,64 u li dawn l-ormoni jistgħu jinfluwenzaw l-orjentazzjoni tal-mikrotubuli65, l-effetti ta' GA fuq l-orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli jistgħu wkoll ikunu medjati minn ormoni oħra.
Studji ċitoloġiċi bikrija wrew li kemm ir-reġjuni ta 'ġewwa kif ukoll ta' barra ta 'l-Arabidopsis SAM huma meħtieġa għall-iżvilupp internode2,42. Il-fatt li GA jirregola b'mod attiv id-diviżjoni taċ-ċelluli fit-tessuti ta 'ġewwa12 jappoġġa funzjoni doppja ta' GA fir-regolazzjoni tad-daqs tal-meristem u l-internode fis-SAM. Il-mudell tad-diviżjoni taċ-ċelluli direzzjonali huwa wkoll regolat sewwa fit-tessut SAM ta 'ġewwa, u dan ir-regolament huwa essenzjali għat-tkabbir taz-zokk52. Ikun interessanti li jiġi eżaminat jekk GA għandux rwol ukoll fl-orjentament tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-organizzazzjoni SAM ta 'ġewwa, u b'hekk jissinkronizza l-ispeċifikazzjoni u l-iżvilupp ta' internodes fi ħdan is-SAM.
Il-pjanti tkabbru in vitro fil-ħamrija jew 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) supplimentat b'1% sukrożju u 1% agar (Sigma) taħt kundizzjonijiet standard (16 h dawl, 22 °C), ħlief għal esperimenti ta 'ipokotil u tkabbir tal-għeruq li fihom in-nebbieta tkabbru fuq pjanċi vertikali taħt dawl kostanti u 22 °C. Għal esperimenti ta 'nitrat, il-pjanti tkabbru fuq medju MS modifikat (medju tal-pjanti bioWORLD) supplimentat b'nitrat adegwat (0 jew 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sukrożju u 1% A-agar (Sigma) taħt kundizzjonijiet ta' ġurnata twila.
GID1a cDNA mdaħħal f'pDONR221 ġie rikombinat ma 'pDONR P4-P1R-pUBQ10 u pDONR P2R-P3-mCherry fi pB7m34GW biex jiġġenera pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA mdaħħal f'pDONR221 ġie rikombinat f'pB7RWG266 biex jiġġenera p35S:IDD2-RFP. Biex tiġġenera pGID1b::2xmTQ2-GID1b, framment ta' 3.9 kb 'il fuq mir-reġjun ta' kodifikazzjoni GID1b u framment ta' 4.7 kb li fih is-cDNA GID1b (1.3 kb) u t-terminatur (3.4 kb) ġew l-ewwel amplifikati bl-użu tal-primers fit-Tabella Supplimentari P1R imdaħħla f'P1R u mbagħad PR4 Xjentifiku) u pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), rispettivament, u finalment rikombinati ma 'pDONR221 2xmTQ268 fil-vettur fil-mira pGreen 012567 bl-użu ta' klonazzjoni Gateway. Biex tiġġenera pCUC2::LSSmOrange, is-sekwenza tal-promotur CUC2 (3229 bp upstream ta 'ATG) segwita mis-sekwenza ta' kodifikazzjoni ta 'mOrange kbir Stokes-shifted (LSSmOrange)69 bis-sinjal tal-lokalizzazzjoni nukleari N7 u t-terminatur traskrizzjoni NOS ġew assemblati fis-sistema pGreen ta' kanamycin tar-rikombinazzjoni tar-rikombinazzjoni ta' kanamycin3. (Invitrogen). Il-vettur binarju tal-pjanti ġie introdott f'Agrobacterium tumefaciens razza GV3101 u introdott fil-weraq Nicotiana benthamiana permezz tal-metodu ta 'infiltrazzjoni Agrobacterium u f'Arabidopsis thaliana Col-0 bil-metodu ta' dip tal-fjuri, rispettivament. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry u pCLV3::mCherry-NLS qmRGA kienu iżolati mill-proġenji F3 u F1 tas-slaleb rispettivi, rispettivament.
L-ibridizzazzjoni in situ ta 'RNA twettqet fuq tips tar-rimjiet twal ta' madwar 1 ċm72, li nġabru u ġew imwaħħla immedjatament f'soluzzjoni FAA (3.7% formaldehyde, 5% aċidu aċetiku, 50% etanol) imkessaħ minn qabel għal 4 °C. Wara trattamenti vakwu 2 × 15 min, l-iffissant inbidel u l-kampjuni ġew inkubati matul il-lejl. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, u RGL3 cDNAs u sondi antisense għat-3′-UTRs tagħhom ġew sintetizzati bl-użu tal-primers murija fit-Tabella Supplimentari 3 kif deskritt minn Rosier et al.73. Sondi ttikkettjati b'digoxigenin ġew immunodetected bl-użu ta' antikorpi digoxigenin (dilwizzjoni ta' 3000 darba; Roche, numru tal-katalgu: 11 093 274 910), u s-sezzjonijiet kienu mtebbgħin b'5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-il darba tetrazolium) dilwizzjoni ta’ 200 darba).
Ħin tal-post: Frar-10-2025