It-tkabbir tal-meristem apikali tar-rimja (SAM) huwa kritiku għall-arkitettura taz-zokk. Ormoni tal-pjantigibberelliniIl-(GAs) għandhom rwoli ewlenin fil-koordinazzjoni tat-tkabbir tal-pjanti, iżda r-rwol tagħhom fis-SAM għadu mhux mifhum sew. Hawnhekk, żviluppajna bijosensur razzometriku tas-sinjalar GA billi inġinerjajna l-proteina DELLA biex trażżan il-funzjoni regolatorja essenzjali tagħha fir-rispons traskrizzjonali GA filwaqt li tippreserva d-degradazzjoni tagħha mal-għarfien GA. Nuru li dan il-bijosensur ibbażat fuq id-degradazzjoni jirreġistra b'mod preċiż il-bidliet fil-livelli GA u s-sensing ċellulari matul l-iżvilupp. Użajna dan il-bijosensur biex nimmappjaw l-attività tas-sinjalar GA fis-SAM. Nuru li sinjali GA għoljin huma preżenti predominantement f'ċelloli li jinsabu bejn il-primordija tal-organi, li huma prekursuri għaċ-ċelloli internodi. Bl-użu ta' approċċi ta' qligħ u telf ta' funzjoni, nuru wkoll li l-GA tirregola l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelloli, u tistabbilixxi l-organizzazzjoni ċellulari kanonika tal-internodi, u b'hekk tippromwovi l-ispeċifikazzjoni tal-internodi fis-SAM.
Il-meristema apikali tar-rimja (SAM), li tinsab fl-apiċi tar-rimja, fiha niċċa ta’ ċelloli staminali li l-attività tagħhom tiġġenera organi laterali u nodi taz-zokk b’mod modulari u iterattiv matul il-ħajja tal-pjanta. Kull waħda minn dawn l-unitajiet ripetuti, jew nodi tal-pjanti, tinkludi internodi u organi laterali fin-nodi, u meristemi axillari fl-axilli tal-weraq1. It-tkabbir u l-organizzazzjoni tan-nodi tal-pjanti jinbidlu matul l-iżvilupp. F’Arabidopsis, it-tkabbir internodali huwa mrażżan matul l-istadju veġetattiv, u l-meristemi axillari jibqgħu rieqda fl-axilli tal-weraq tar-rożetta. Matul it-tranżizzjoni għall-fażi tal-fjuri, is-SAM issir il-meristema tal-fjoritura, u tiġġenera internodi tawwalin u blanzuni axillari, friegħi fl-axilli tal-weraq kawlini, u aktar tard, fjuri bla weraq2. Għalkemm għamilna progress sinifikanti fil-fehim tal-mekkaniżmi li jikkontrollaw l-bidu tal-weraq, il-fjuri u l-friegħi, relattivament ftit li xejn huwa magħruf dwar kif jinqalgħu l-internodi.
Il-fehim tad-distribuzzjoni spazjotemporali tal-GAs se jgħin biex nifhmu aħjar il-funzjonijiet ta’ dawn l-ormoni f’tessuti differenti u fi stadji ta’ żvilupp differenti. Il-viżwalizzazzjoni tad-degradazzjoni tal-fużjoni RGA-GFP espressa taħt l-azzjoni tal-promotur tagħha stess tipprovdi informazzjoni importanti dwar ir-regolazzjoni tal-livelli totali ta’ GA fl-għeruq15,16. Madankollu, l-espressjoni tal-RGA tvarja bejn it-tessuti17 u hija regolata minn GA18. Għalhekk, l-espressjoni differenzjali tal-promotur tal-RGA tista’ tirriżulta fix-xejra tal-fluworexxenza osservata b’RGA-GFP u għalhekk dan il-metodu mhuwiex kwantitattiv. Aktar reċentement, GA19,20 immarkat bil-fluworexxeina bijoattiva (Fl) żvela l-akkumulazzjoni ta’ GA fl-endokortiċi tal-għeruq u r-regolazzjoni tal-livelli ċellulari tiegħu permezz tat-trasport tal-GA. Riċentement, is-senser GA FRET nlsGPS1 wera li l-livelli ta’ GA jikkorrelataw mat-titwil taċ-ċelluli fl-għeruq, filamenti, u ipokotilji mkabbra fid-dlam21. Madankollu, kif rajna, il-konċentrazzjoni tal-GA mhijiex l-uniku parametru li jikkontrolla l-attività tas-sinjalar tal-GA, peress li tiddependi fuq proċessi kumplessi ta’ sensing. Hawnhekk, billi nibnu fuq il-fehim tagħna tal-mogħdijiet tas-sinjalar DELLA u GA, nirrappurtaw l-iżvilupp u l-karatterizzazzjoni ta' bijosensur razzometriku bbażat fuq id-degradazzjoni għas-sinjalar GA. Biex niżviluppaw dan il-bijosensur kwantitattiv, użajna RGA mutanti sensittiv għall-GA li kien imdewweb ma' proteina fluworexxenti u espress b'mod mifrux fit-tessuti, kif ukoll proteina fluworexxenti insensittiva għall-GA. Nuru li l-fużjonijiet tal-proteini RGA mutanti ma jinterferixxux mas-sinjalar endoġenu GA meta espress b'mod mifrux, u li dan il-bijosensur jista' jikkwantifika l-attività tas-sinjalar li tirriżulta kemm mill-input GA kif ukoll mill-ipproċessar tas-sinjal GA mill-apparat tas-sensing b'riżoluzzjoni spazjotemporali għolja. Użajna dan il-bijosensur biex nimmappjaw id-distribuzzjoni spazjotemporali tal-attività tas-sinjalar GA u nikkwantifikaw kif GA tirregola l-imġiba ċellulari fl-epidermide SAM. Nuru li GA tirregola l-orjentazzjoni tal-pjan ta' diviżjoni taċ-ċelloli SAM li jinsabu bejn il-primordija tal-organi, u b'hekk tiddefinixxi l-organizzazzjoni ċellulari kanonika tal-internodu.
Fl-aħħar nett, staqsejna jekk il-qmRGA jistax jirrapporta bidliet fil-livelli endoġeni tal-GA bl-użu ta' ipokotili li qed jikbru. Preċedentement wrejna li n-nitrat jistimula t-tkabbir billi jżid is-sintesi tal-GA u, min-naħa tiegħu, id-degradazzjoni ta' DELLA34. Għaldaqstant, osservajna li t-tul tal-ipokotil fin-nebbieta pUBQ10::qmRGA mkabbra taħt provvista abbundanti ta' nitrat (10 mM NO3−) kien sinifikament itwal minn dak fin-nebbieta mkabbra taħt kundizzjonijiet defiċjenti fin-nitrat (Fig. Supplimentari 6a). Konsistenti mar-rispons għat-tkabbir, is-sinjali tal-GA kienu ogħla fl-ipokotili tan-nebbieta mkabbra taħt kundizzjonijiet ta' 10 mM NO3− milli fin-nebbieta mkabbra fin-nuqqas ta' nitrat (Fig. Supplimentari 6b, c). Għalhekk, il-qmRGA jippermetti wkoll il-monitoraġġ tal-bidliet fis-sinjalar tal-GA kkaġunati minn bidliet endoġeni fil-konċentrazzjoni tal-GA.
Biex nifhmu jekk l-attività tas-sinjalar GA skoperta minn qmRGA tiddependix fuq il-konċentrazzjoni GA u l-perċezzjoni GA, kif mistenni bbażat fuq id-disinn tas-sensur, analizzajna l-espressjoni tat-tliet riċetturi GID1 fit-tessuti veġetattivi u riproduttivi. Fin-nebbieta, il-linja reporter GID1-GUS uriet li GID1a u c kienu espressi ħafna fil-kotiledoni (Fig. 3a–c). Barra minn hekk, it-tliet riċetturi kienu espressi fil-weraq, primordia tal-għeruq laterali, ponot tal-għeruq (ħlief għall-kappa tal-għeruq ta' GID1b), u s-sistema vaskulari (Fig. 3a–c). Fis-SAM tal-fjoritura, skoprejna sinjali GUS biss għal GID1b u 1c (Fig. Supplimentari 7a–c). L-ibridizzazzjoni in situ kkonfermat dawn ix-xejriet ta' espressjoni u wriet aktar li GID1c kien espress b'mod uniformi f'livelli baxxi fis-SAM, filwaqt li GID1b wera espressjoni ogħla fil-periferija tas-SAM (Fig. Supplimentari 7d–l). Il-fużjoni translazzjonali pGID1b::2xmTQ2-GID1b żvelat ukoll firxa gradwata ta' espressjoni ta' GID1b, minn espressjoni baxxa jew xejn fiċ-ċentru tas-SAM għal espressjoni għolja fil-fruntieri tal-organi (Fig. Supplimentari 7m). Għalhekk, ir-riċetturi GID1 mhumiex imqassma b'mod uniformi madwar u fi ħdan it-tessuti. F'esperimenti sussegwenti, osservajna wkoll li l-espressjoni żejda ta' GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) żiedet is-sensittività ta' qmRGA fl-ipokotil għall-applikazzjoni esterna ta' GA (Fig. 3d, e). B'kuntrast, il-fluworexxenza mkejla minn qd17mRGA fl-ipokotil ma kinitx sensittiva għat-trattament ta' GA3 (Fig. 3f, g). Għaż-żewġ analiżi, in-nebbieta ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet għoljin ta' GA (100 μM GA3) biex jiġi vvalutat l-imġiba rapida tas-senser, fejn il-kapaċità li jingħaqad mar-riċettur GID1 tjiebet jew intilfet. Flimkien, dawn ir-riżultati jikkonfermaw li l-bijosensur qmRGA jservi funzjoni kkombinata bħala sensur GA u GA, u jissuġġerixxu li l-espressjoni differenzjali tar-riċettur GID1 tista' timmodula b'mod sinifikanti l-emissività tas-sensur.
Sal-lum, id-distribuzzjoni tas-sinjali GA fis-SAM għadha mhix ċara. Għalhekk, użajna pjanti li jesprimu qmRGA u r-reporter taċ-ċelloli staminali pCLV3::mCherry-NLS35 biex nikkalkulaw mapep kwantitattivi ta' riżoluzzjoni għolja tal-attività tas-sinjalar GA, b'fokus fuq is-saff L1 (epidermide; Fig. 4a, b, ara Metodi u Metodi Supplimentari), peress li L1 għandu rwol ewlieni fil-kontroll tat-tkabbir tas-SAM36. Hawnhekk, l-espressjoni pCLV3::mCherry-NLS ipprovdiet punt ta' referenza ġeometriku fiss għall-analiżi tad-distribuzzjoni spatiotemporali tal-attività tas-sinjalar GA37. Għalkemm GA hija kkunsidrata essenzjali għall-iżvilupp tal-organi laterali4, osservajna li s-sinjali GA kienu baxxi fil-primordju tal-fjuri (P) li jibda mill-istadju P3 (Fig. 4a, b), filwaqt li l-primordji żgħar P1 u P2 kellhom attività moderata simili għal dik fir-reġjun ċentrali (Fig. 4a, b). Attività ogħla ta' sinjalazzjoni GA ġiet skoperta fil-konfini tal-primordija tal-organi, li tibda minn P1/P2 (fil-ġnub tal-konfini) u tilħaq il-quċċata f'P4, kif ukoll fiċ-ċelloli kollha tar-reġjun periferali li jinsab bejn il-primordija (Fig. 4a, b u Fig. Supplimentari 8a, b). Din l-attività ogħla ta' sinjalazzjoni GA ġiet osservata mhux biss fl-epidermide iżda wkoll fis-saffi L2 u ta' fuq L3 (Fig. Supplimentari 8b). Il-mudell tas-sinjali GA skoperti fis-SAM bl-użu ta' qmRGA baqa' wkoll l-istess maż-żmien (Fig. Supplimentari 8c–f, k). Għalkemm il-kostruzzjoni qd17mRGA ġiet regolata sistematikament 'l isfel fis-SAM tal-pjanti T3 minn ħames linji indipendenti li kkaratterizzajna fid-dettall, stajna nanalizzaw il-mudelli ta' fluworexxenza miksuba bil-kostruzzjoni pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. Supplimentari 8g–j, l). F'din il-linja ta' kontroll, instabu biss bidliet żgħar fil-proporzjon tal-fluworexxenza fis-SAM, iżda fiċ-ċentru tas-SAM osservajna tnaqqis ċar u mhux mistenni f'VENUS assoċjat ma' TagBFP. Dan jikkonferma li x-xejra tas-sinjalar osservata minn qmRGA tirrifletti d-degradazzjoni dipendenti fuq GA ta' mRGA-VENUS, iżda turi wkoll li qmRGA tista' tissopravaluta l-attività tas-sinjalar GA fiċ-ċentru tal-meristem. Fil-qosor, ir-riżultati tagħna juru xejra tas-sinjalar GA li primarjament tirrifletti d-distribuzzjoni tal-primordja. Din id-distribuzzjoni tar-reġjun inter-primordjali (IPR) hija dovuta għall-istabbiliment gradwali ta' attività għolja ta' sinjalar GA bejn il-primordju li qed jiżviluppa u r-reġjun ċentrali, filwaqt li fl-istess ħin l-attività tas-sinjalar GA fil-primordju tonqos (Fig. 4c, d).
Id-distribuzzjoni tar-riċetturi GID1b u GID1c (ara hawn fuq) tissuġġerixxi li l-espressjoni differenzjali tar-riċetturi GA tgħin biex tifforma l-mudell tal-attività tas-sinjalar GA fis-SAM. Staqsejna jekk l-akkumulazzjoni differenzjali ta' GA tistax tkun involuta. Biex ninvestigaw din il-possibbiltà, użajna s-sensor nlsGPS1 GA FRET21. Żieda fil-frekwenza tal-attivazzjoni ġiet skoperta fis-SAM ta' nlsGPS1 ittrattat b'10 μM GA4+7 għal 100 minuta (Fig. Supplimentari 9a-e), li jindika li nlsGPS1 jirrispondi għal bidliet fil-konċentrazzjoni ta' GA fis-SAM, kif jagħmel fl-għeruq21. Id-distribuzzjoni spazjali tal-frekwenza tal-attivazzjoni nlsGPS1 żvelat livelli relattivament baxxi ta' GA fis-saffi ta' barra tas-SAM, iżda wriet li kienu elevati fiċ-ċentru u fil-fruntieri tas-SAM (Fig. 4e u Fig. Supplimentari 9a,c). Dan jissuġġerixxi li GA hija wkoll distribwita fis-SAM b'mudell spazjali komparabbli ma' dak żvelat minn qmRGA. Bħala approċċ komplementari, ittrattajna wkoll is-SAM b'GA fluworexxenti (GA3-, GA4-, GA7-Fl) jew Fl waħdu bħala kontroll negattiv. Is-sinjal Fl kien imqassam madwar is-SAM, inkluż ir-reġjun ċentrali u l-primordju, għalkemm b'intensità aktar baxxa (Fig. 4j u Fig. Supplimentari 10d). B'kuntrast, it-tliet GA-Fl kollha akkumulaw speċifikament fil-fruntieri tal-primordju u fi gradi differenti fil-bqija tal-IPR, bil-GA7-Fl jakkumula fl-akbar dominju fl-IPR (Fig. 4k u Fig. Supplimentari 10a,b). Il-kwantifikazzjoni tal-intensità tal-fluworexxenza żvelat li l-proporzjon tal-intensità IPR għal dik mhux IPR kien ogħla fis-SAM ittrattata b'GA-Fl meta mqabbla mas-SAM ittrattata b'Fl (Fig. 4l u Fig. Supplimentari 10c). Flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-GA hija preżenti f'konċentrazzjonijiet ogħla fiċ-ċelloli IPR li jinsabu l-eqreb tal-fruntiera tal-organu. Dan jissuġġerixxi li l-mudell tal-attività tas-sinjalar GA tas-SAM jirriżulta kemm mill-espressjoni differenzjali tar-riċetturi GA kif ukoll mill-akkumulazzjoni differenzjali ta' GA fiċ-ċelloli IPR qrib il-fruntieri tal-organi. Għalhekk, l-analiżi tagħna żvelat mudell spazjotemporali mhux mistenni tas-sinjalar GA, b'attività aktar baxxa fiċ-ċentru u l-primordju tas-SAM u attività ogħla fl-IPR fir-reġjun periferali.
Biex nifhmu r-rwol tal-attività differenzjali tas-sinjalar GA fis-SAM, analizzajna l-korrelazzjoni bejn l-attività tas-sinjalar GA, l-espansjoni taċ-ċelluli, u d-diviżjoni taċ-ċelluli bl-użu ta' immaġini time-lapse f'ħin reali tas-SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Minħabba r-rwol tal-GA fir-regolazzjoni tat-tkabbir, kienet mistennija korrelazzjoni pożittiva mal-parametri tal-espansjoni taċ-ċelluli. Għalhekk, l-ewwel qabbilna l-mapep tal-attività tas-sinjalar GA mal-mapep tar-rata tat-tkabbir tal-wiċċ taċ-ċelluli (bħala prokura għas-saħħa tal-espansjoni taċ-ċelluli għal ċellula partikolari u għaċ-ċelluli bint fid-diviżjoni) u mal-mapep tal-anisotropija tat-tkabbir, li tkejjel id-direzzjonalità tal-espansjoni taċ-ċelluli (użata wkoll hawn għal ċellula partikolari u għaċ-ċelluli bint fid-diviżjoni; Fig. 5a,b, ara Metodi u Metodi Supplimentari). Il-mapep tagħna tar-rata tat-tkabbir tal-wiċċ taċ-ċelluli SAM huma konsistenti ma' osservazzjonijiet preċedenti38,39, b'rati minimi ta' tkabbir fil-fruntiera u rati massimi ta' tkabbir fil-fjuri li qed jiżviluppaw (Fig. 5a). L-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) uriet li l-attività tas-sinjalar GA kienet korrelata b'mod negattiv mal-intensità tat-tkabbir tal-wiċċ taċ-ċelluli (Figura 5c). Urejna wkoll li l-assi ewlenin ta' varjazzjoni, inkluż l-input tas-sinjalar GA u l-intensità tat-tkabbir, kienu ortogonali għad-direzzjoni determinata minn espressjoni għolja ta' CLV3, u dan jikkonferma l-esklużjoni taċ-ċelloli miċ-ċentru SAM fl-analiżi li fadal. L-analiżi tal-korrelazzjoni ta' Spearman ikkonfermat ir-riżultati tal-PCA (Figura 5d), u dan jindika li sinjali GA ogħla fl-IPR ma rriżultawx f'espansjoni ogħla taċ-ċelloli. Madankollu, l-analiżi tal-korrelazzjoni żvelat korrelazzjoni pożittiva żgħira bejn l-attività tas-sinjalar GA u l-anisotropija tat-tkabbir (Figura 5c, d), li tissuġġerixxi li sinjalar GA ogħla fl-IPR jinfluwenza d-direzzjoni tat-tkabbir taċ-ċelloli u possibbilment il-pożizzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelloli.
a, b Mapep tas-sħana tat-tkabbir medju tal-wiċċ (a) u l-anisotropija tat-tkabbir (b) fis-SAM medjati fuq seba' pjanti indipendenti (użati bħala proxies għas-saħħa u d-direzzjoni tal-espansjoni taċ-ċelluli, rispettivament). c L-analiżi tal-PCA inkludiet il-varjabbli li ġejjin: sinjal GA, intensità tat-tkabbir tal-wiċċ, anisotropija tat-tkabbir tal-wiċċ, u espressjoni CLV3. Il-komponent 1 tal-PCA kien prinċipalment korrelat b'mod negattiv mal-intensità tat-tkabbir tal-wiċċ u korrelat b'mod pożittiv mas-sinjal GA. Il-komponent 2 tal-PCA kien prinċipalment korrelat b'mod pożittiv mal-anisotropija tat-tkabbir tal-wiċċ u korrelat b'mod negattiv mal-espressjoni CLV3. Il-perċentwali jirrappreżentaw il-varjazzjoni spjegata minn kull komponent. d Analiżi tal-korrelazzjoni ta' Spearman bejn is-sinjal GA, l-intensità tat-tkabbir tal-wiċċ, u l-anisotropija tat-tkabbir tal-wiċċ fuq l-iskala tat-tessut eskluża s-CZ. In-numru fuq il-lemin huwa l-valur rho ta' Spearman bejn żewġ varjabbli. L-asterisks jindikaw każijiet fejn il-korrelazzjoni/korrelazzjoni negattiva hija sinifikanti ħafna. e Viżwalizzazzjoni 3D taċ-ċelluli Col-0 SAM L1 permezz ta' mikroskopija konfokali. Ħitan taċ-ċelluli ġodda ffurmati fis-SAM (iżda mhux il-primordju) f'10 sigħat huma kkuluriti skont il-valuri tal-angolu tagħhom. Il-bar tal-kulur jidher fir-rokna t'isfel tal-lemin. L-inserzjoni turi l-immaġni 3D korrispondenti f'0 siegħa. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. f Il-plotts tal-kaxxa juru r-rati tad-diviżjoni taċ-ċelluli f'IPR u mhux IPR Col-0 SAM (n = 10 pjanti indipendenti). Il-linja taċ-ċentru turi l-medjan, u l-konfini tal-kaxxa jindikaw il-25 u l-75 perċentil. Il-whiskers jindikaw il-valuri minimi u massimi determinati bis-softwer R. Il-valuri P inkisbu bit-test-t b'żewġ dnub ta' Welch. g, h Dijagramma skematika li turi (g) kif jitkejjel l-angolu tal-ħajt taċ-ċellula l-ġdid (magenta) fir-rigward tad-direzzjoni radjali miċ-ċentru tas-SAM (linja bajda bit-tikek) (valuri tal-angolu akut biss, jiġifieri, 0–90°, huma kkunsidrati), u (h) id-direzzjonijiet ċirkoferenzjali/laterali u radjali fil-meristema. i Istogrammi tal-frekwenza tal-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli tul is-SAM (blu skur), IPR (blu medju), u mhux IPR (blu ċar), rispettivament. Il-valuri P inkisbu permezz ta' test Kolmogorov-Smirnov b'żewġ dnub. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. j Istogrammi tal-frekwenza tal-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli tal-IPR madwar P3 (aħdar ċar), P4 (aħdar medju), u P5 (aħdar skur), rispettivament. Il-valuri P inkisbu permezz ta' test Kolmogorov-Smirnov b'żewġ dnub. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili.
Għalhekk, wara investigajna l-korrelazzjoni bejn is-sinjalar GA u l-attività tad-diviżjoni taċ-ċelluli billi identifikajna ħitan taċ-ċelluli ffurmati ġodda matul l-assaġġ (Fig. 5e). Dan l-approċċ ippermettielna nkejlu l-frekwenza u d-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli. B'mod sorprendenti, sibna li l-frekwenza tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fl-IPR u l-bqija tas-SAM (mhux IPR, Fig. 5f) kienet simili, li tindika li d-differenzi fis-sinjalar GA bejn iċ-ċelluli IPR u dawk mhux IPR ma jaffettwawx b'mod sinifikanti d-diviżjoni taċ-ċelluli. Dan, u l-korrelazzjoni pożittiva bejn is-sinjalar GA u l-anisotropija tat-tkabbir, wassluna biex nikkunsidraw jekk l-attività tas-sinjalar GA tistax tinfluwenza l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli. Kejjilna l-orjentazzjoni tal-ħajt taċ-ċellula l-ġdida bħala angolu akut relattiv għall-assi radjali li jgħaqqad iċ-ċentru tal-meristem u ċ-ċentru tal-ħajt taċ-ċellula l-ġdida (Fig. 5e-i) u osservajna tendenza ċara għaċ-ċelloli li jinqasmu f'angoli qrib id-90° relattiv għall-assi radjali, bl-ogħla frekwenzi osservati f'70–80° (23.28%) u 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), li jikkorrispondu għal diviżjonijiet taċ-ċelloli fid-direzzjoni ċirkoferenzjali/trasversali (Fig. 5h). Biex neżaminaw il-kontribut tas-sinjalar GA għal dan l-imġiba tad-diviżjoni taċ-ċelloli, analizzajna l-parametri tad-diviżjoni taċ-ċelloli fl-IPR u fin-non-IPR separatament (Fig. 5i). Osservajna li d-distribuzzjoni tal-angolu tad-diviżjoni fiċ-ċelloli IPR kienet differenti minn dik fiċ-ċelloli mhux IPR jew fiċ-ċelloli fis-SAM kollu, biċ-ċelloli IPR li juru proporzjon ogħla ta' diviżjonijiet taċ-ċelloli laterali/ċirkolari, jiġifieri, 70–80° u 80–90° (33.86% u 30.71%, rispettivament, proporzjonijiet korrispondenti) (Fig. 5i). Għalhekk, l-osservazzjonijiet tagħna żvelaw assoċjazzjoni bejn sinjalazzjoni GA għolja u orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelloli qrib id-direzzjoni ċirkoferenzjali, simili għall-korrelazzjoni bejn l-attività tas-sinjalazzjoni GA u l-anisotropija tat-tkabbir (Fig. 5c, d). Biex nistabbilixxu aktar il-konservazzjoni spazjali ta' din l-assoċjazzjoni, kejjilna l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni fiċ-ċelloli IPR li jdawru l-primordju u jibdew minn P3, peress li l-ogħla attività tas-sinjalazzjoni GA ġiet skoperta f'dan ir-reġjun u jibdew minn P4 (Fig. 4). L-angoli tad-diviżjoni tal-IPR madwar P3 u P4 ma wrew l-ebda differenza statistikament sinifikanti, għalkemm ġiet osservata frekwenza akbar ta' diviżjonijiet taċ-ċelloli laterali fl-IPR madwar P4 (Fig. 5j). Madankollu, fiċ-ċelloli IPR madwar P5, id-differenza fl-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelloli saret statistikament sinifikanti, b'żieda qawwija fil-frekwenza tad-diviżjonijiet trasversali taċ-ċelloli (Fig. 5j). Flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li s-sinjalar GA jista' jikkontrolla l-orjentazzjoni tad-diviżjonijiet taċ-ċelloli fis-SAM, li huwa konsistenti ma' rapporti preċedenti40,41 li sinjalar GA għoli jista' jikkaġuna orjentazzjoni laterali tad-diviżjonijiet taċ-ċelloli fl-IPR.
Huwa mbassar li ċ-ċelloli fl-IPR mhux se jiġu inkorporati fil-primordija iżda pjuttost fl-internodi2,42,43. L-orjentazzjoni trasversali tad-diviżjonijiet taċ-ċelloli fl-IPR tista' tirriżulta fl-organizzazzjoni tipika ta' ringieli lonġitudinali paralleli ta' ċelloli epidermali fl-internodi. L-osservazzjonijiet tagħna deskritti hawn fuq jissuġġerixxu li s-sinjalar GA x'aktarx għandu rwol f'dan il-proċess billi jirregola d-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelloli.
It-telf tal-funzjoni ta' diversi ġeni DELLA jirriżulta f'rispons GA kostituttiv, u l-mutanti della jistgħu jintużaw biex tittestja din l-ipoteżi44. L-ewwel analizzajna l-mudelli ta' espressjoni ta' ħames ġeni DELLA fis-SAM. Il-fużjoni traskrizzjonali tal-linja GUS45 żvelat li GAI, RGA, RGL1, u RGL2 (sa punt ħafna inqas) kienu espressi fis-SAM (Fig. Supplimentari 11a–d). L-ibridizzazzjoni in situ wriet ukoll li l-mRNA tal-GAI jakkumula speċifikament fil-primordija u l-fjuri li qed jiżviluppaw (Fig. Supplimentari 11e). L-mRNA tal-RGL1 u l-RGL3 instabu fil-kanupew kollu tas-SAM u fil-fjuri aktar anzjani, filwaqt li l-mRNA tal-RGL2 kien aktar abbundanti fir-reġjun tal-fruntiera (Fig. Supplimentari 11f–h). L-immaġini konfokali tal-pRGL3::RGL3-GFP SAM ikkonfermat l-espressjoni osservata permezz tal-ibridizzazzjoni in situ u wriet li l-proteina RGL3 takkumula fil-parti ċentrali tas-SAM (Fig. Supplimentari 11i). Bl-użu tal-linja pRGA::GFP-RGA, sibna wkoll li l-proteina RGA takkumula fis-SAM, iżda l-abbundanza tagħha tonqos fil-fruntiera li tibda minn P4 (Fig. Supplimentari 11j). Ta' min jinnota li x-xejriet ta' espressjoni ta' RGL3 u RGA huma konsistenti ma' attività ogħla ta' sinjalazzjoni GA fl-IPR, kif skopert minn qmRGA (Fig. 4). Barra minn hekk, din id-dejta tindika li d-DELLAs kollha huma espressi fis-SAM u li l-espressjoni tagħhom kollettivament tkopri s-SAM kollu.
Imbagħad analizzajna l-parametri tad-diviżjoni taċ-ċelluli fis-SAM tat-tip selvaġġ (Ler, kontroll) u l-mutanti gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globali) (Fig. 6a, b). Interessanti, osservajna bidla statistikament sinifikanti fid-distribuzzjoni tal-frekwenzi tal-angolu tad-diviżjoni taċ-ċelluli fil-mutant della globali SAM meta mqabbel mat-tip selvaġġ (Fig. 6c). Din il-bidla fil-mutant della globali kienet dovuta għal żieda fil-frekwenza ta' angoli ta' 80–90° (34.71% vs. 24.55%) u, sa ċertu punt, angoli ta' 70–80° (23.78% vs. 20.18%), jiġifieri, li jikkorrispondu għal diviżjonijiet trasversali taċ-ċelluli (Fig. 6c). Il-frekwenza ta' diviżjonijiet mhux trasversali (0–60°) kienet ukoll aktar baxxa fil-mutant della globali (Fig. 6c). Il-frekwenza ta' diviżjonijiet trasversali taċ-ċelluli żdiedet b'mod sinifikanti fis-SAM tal-mutant della globali (Fig. 6b). Il-frekwenza tad-diviżjonijiet trasversali taċ-ċelluli fl-IPR kienet ukoll ogħla fil-mutant globali della meta mqabbel mat-tip selvaġġ (Fig. 6d). Barra r-reġjun tal-IPR, it-tip selvaġġ kellu distribuzzjoni aktar uniformi tal-angoli tad-diviżjoni taċ-ċelluli, filwaqt li l-mutant globali della pprefera diviżjonijiet tanġenzjali bħall-IPR (Fig. 6e). Aħna kwantifikajna wkoll l-orjentazzjoni tad-diviżjonijiet taċ-ċelluli fis-SAM tal-mutanti kwintupli tal-ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, u ga2ox6-2), sfond mutanti inattiv tal-GA li fih jakkumula l-GA. Konsistenti maż-żieda fil-livelli ta' GA, is-SAM tal-fjoritura mutanti kwintupla ga2ox kienet akbar minn dik ta' Col-0 (Fig. Supplimentari 12a, b), u meta mqabbla ma' Col-0, is-SAM kwintupla ga2ox wriet distribuzzjoni distintament differenti tal-angoli tad-diviżjoni taċ-ċelluli, bil-frekwenza tal-angolu tiżdied minn 50° għal 90°, jiġifieri għal darb'oħra tiffavorixxi d-diviżjonijiet tanġenzjali (Fig. Supplimentari 12a–c). Għalhekk, nuru li l-attivazzjoni kostituttiva tas-sinjalar GA u l-akkumulazzjoni GA jinduċu diviżjonijiet laterali taċ-ċelluli fl-IPR u l-bqija tas-SAM.
a, b Viżwalizzazzjoni 3D tas-saff L1 ta' Ler (a) imtebba' bil-PI u l-mutant globali tad-della (b) SAM bl-użu ta' mikroskopija konfokali. Ħitan taċ-ċelluli ġodda ffurmati fis-SAM (iżda mhux fil-primordju) fuq perjodu ta' 10 sigħat huma murija u kkuluriti skont il-valuri tal-angolu tagħhom. L-inserzjoni turi s-SAM f'0 sigħat. Il-bar tal-kulur huwa muri fir-rokna t'isfel tal-lemin. Il-vleġġa f'(b) tipponta lejn eżempju ta' fajls taċ-ċelluli allinjati fil-mutant globali tad-della. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. paragun tad-distribuzzjoni tal-frekwenza tal-orjentazzjonijiet tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fis-SAM kollu (d), IPR (e), u mhux IPR (f) bejn Ler u della globali. Il-valuri P inkisbu bl-użu ta' test Kolmogorov-Smirnov b'żewġ dnub. f, g Viżwalizzazzjoni 3D ta' immaġini konfokali ta' SAM imtebba' bil-PI ta' pjanti transġeniċi Col-0 (i) u pCUC2::gai-1-VENUS (j). Il-pannelli (a, b) juru ħitan taċ-ċelluli ġodda (iżda mhux primordja) iffurmati fis-SAM fi żmien 10 sigħat. L-esperiment ġie ripetut darbtejn b'riżultati simili. h–j Paragun tad-distribuzzjoni tal-frekwenza tal-orjentazzjonijiet tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli li jinsabu fis-SAM kollu (h), IPR (i) u non-IPR (j) bejn il-pjanti Col-0 u pCUC2::gai-1-VENUS. Il-valuri P inkisbu bl-użu ta' test Kolmogorov-Smirnov b'żewġ dnub.
Imbagħad ittestjajna l-effett tal-inibizzjoni tas-sinjalar GA speċifikament fl-IPR. Għal dan il-għan, użajna l-promotur cotyledon cup 2 (CUC2) biex imexxu l-espressjoni ta' proteina gai-1 negattiva dominanti magħquda ma' VENUS (fil-linja pCUC2::gai-1-VENUS). Fis-SAM tat-tip selvaġġ, il-promotur CUC2 imexxu l-espressjoni tal-biċċa l-kbira tal-IPRs fis-SAM, inklużi ċ-ċelloli tal-fruntiera, minn P4 'il quddiem, u espressjoni speċifika simili ġiet osservata fil-pjanti pCUC2::gai-1-VENUS (ara hawn taħt). Id-distribuzzjoni tal-angoli tad-diviżjoni taċ-ċelloli tul is-SAM jew l-IPR tal-pjanti pCUC2::gai-1-VENUS ma kinitx differenti b'mod sinifikanti minn dik tat-tip selvaġġ, għalkemm b'mod mhux mistenni sibna li ċ-ċelloli mingħajr IPR f'dawn il-pjanti ddividew bi frekwenza ogħla ta' 80–90° (Fig. 6f–j).
Ġie ssuġġerit li d-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli tiddependi fuq il-ġeometrija tas-SAM, b'mod partikolari l-istress tensili ġġenerat mill-kurvatura tat-tessut46. Għalhekk staqsejna jekk il-forma tas-SAM kinitx mibdula fil-pjanti della globali mutant u pCUC2::gai-1-VENUS. Kif irrappurtat qabel12, id-daqs tal-pjanti della globali mutant SAM kien akbar minn dak tat-tip selvaġġ (Fig. Supplimentari 13a, b, d). L-ibridizzazzjoni in situ ta' CLV3 u STM RNA kkonfermat l-espansjoni tal-meristem fil-mutanti della u wriet ukoll l-espansjoni laterali tan-niċċa taċ-ċelluli staminali (Fig. Supplimentari 13e, f, h, i). Madankollu, il-kurvatura tas-SAM kienet simili fiż-żewġ ġenotipi (Fig. Supplimentari 13k, m, n, p). Osservajna żieda simili fid-daqs fil-mutant gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mingħajr bidla fil-kurvatura meta mqabbla mat-tip selvaġġ (Fig. Supplimentari 13c, d, g, j, l, o, p). Il-frekwenza tal-orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli ġiet affettwata wkoll fil-mutant quadruple della, iżda sa ċertu punt inqas milli fil-mutant monolitiku della (Fig. Supplimentari 12d–f). Dan l-effett tad-dożaġġ, flimkien man-nuqqas ta' effett fuq il-kurvatura, jissuġġerixxi li l-attività residwa ta' RGL3 fil-mutant quadruple Della tillimita l-bidliet fl-orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli kkawżati mit-telf tal-attività DELLA u li l-bidliet fid-diviżjonijiet laterali taċ-ċelluli jseħħu b'reazzjoni għal bidliet fl-attività tas-sinjalar GA aktar milli bidliet fil-ġeometrija tas-SAM. Kif deskritt hawn fuq, il-promotur CUC2 imexxi l-espressjoni tal-IPR fis-SAM li tibda minn P4 (Fig. Supplimentari 14a, b), u b'kuntrast, il-pCUC2::gai-1-VENUS SAM kellu daqs imnaqqas iżda kurvatura ogħla (Fig. Supplimentari 14c–h). Din il-bidla fil-morfoloġija tal-pCUC2::gai-1-VENUS SAM tista' tirriżulta f'distribuzzjoni differenti ta' stress mekkaniku meta mqabbel mat-tip selvaġġ, fejn stress ċirkoferenzjali għoli jibda f'distanza iqsar miċ-ċentru tas-SAM47. Alternattivament, il-bidliet fil-morfoloġija ta' pCUC2::gai-1-VENUS SAM jistgħu jirriżultaw minn bidliet fil-proprjetajiet mekkaniċi reġjonali kkaġunati mill-espressjoni tat-transġene48. Fiż-żewġ każijiet, dan jista' parzjalment jikkumpensa għall-effetti tal-bidliet fis-sinjalar GA billi jżid il-probabbiltà li ċ-ċelloli jinqasmu fl-orjentazzjoni ċirkoferenzjali/trasversali, u dan jispjega l-osservazzjonijiet tagħna.
Meħuda flimkien, id-dejta tagħna tikkonferma li s-sinjalar GA ogħla għandu rwol attiv fl-orjentazzjoni laterali tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR. Juru wkoll li l-kurvatura tal-meristem tinfluwenza wkoll l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-IPR.
L-orjentazzjoni trasversali tal-pjan ta' diviżjoni fl-IPR, minħabba attività għolja ta' sinjalar GA, tissuġġerixxi li GA jorganizza minn qabel fajl taċ-ċelluli radjali fl-epidermide fi ħdan is-SAM biex jiddefinixxi l-organizzazzjoni ċellulari li aktar tard tinstab fl-internodu epidermali. Tabilħaqq, fajls taċ-ċelluli bħal dawn kienu ta' spiss viżibbli fl-immaġini SAM ta' mutanti della globali (Fig. 6b). Għalhekk, biex nesploraw aktar il-funzjoni tal-iżvilupp tal-mudell spazjali tas-sinjalar GA fis-SAM, użajna immaġini time-lapse biex nanalizzaw l-organizzazzjoni spazjali taċ-ċelluli fl-IPR f'pjanti tat-tip selvaġġ (Ler u Col-0), mutanti della globali, u pjanti transġeniċi pCUC2::gai-1-VENUS.
Sibna li qmRGA wera li l-attività tas-sinjalar GA fl-IPR żdiedet minn P1/P2 u laħqet il-quċċata f'P4, u dan il-mudell baqa' kostanti maż-żmien (Fig. 4a–f u Fig. Supplimentari 8c–f, k). Biex nanalizzaw l-organizzazzjoni spazjali taċ-ċelloli fl-IPR b'sinjal GA dejjem jiżdied, ittikkettajna ċ-ċelloli Ler IPR 'il fuq u mal-ġnub ta' P4 skont id-destin tal-iżvilupp tagħhom analizzat 34 siegħa wara l-ewwel osservazzjoni, jiġifieri, aktar minn żewġ darbiet tal-plastidi, li jippermettilna nsegwu ċ-ċelloli IPR matul l-iżvilupp tal-primordju minn P1/P2 sa P4. Użajna tliet kuluri differenti: isfar għal dawk iċ-ċelloli li ġew integrati fil-primordju ħdejn P4, aħdar għal dawk li kienu fl-IPR, u vjola għal dawk li pparteċipaw fiż-żewġ proċessi (Fig. 7a–c). F't0 (0 h), 1–2 saffi ta' ċelloli IPR kienu viżibbli quddiem P4 (Fig. 7a). Kif mistenni, meta dawn iċ-ċelloli qasmu, għamlu dan prinċipalment permezz tal-pjan ta' diviżjoni trasversali (Figs. 7a–c). Riżultati simili nkisbu bl-użu ta' Col-0 SAM (b'fokus fuq P3, li t-tarf tiegħu jintewa b'mod simili għal P4 f'Ler), għalkemm f'dan il-ġenotip it-tinja ffurmata fit-tarf tal-fjuri ħbiet iċ-ċelloli IPR aktar malajr (Fig. 7g–i). Għalhekk, il-mudell ta' diviżjoni taċ-ċelloli IPR jorganizza minn qabel iċ-ċelloli f'ringieli radjali, bħal fl-internodi. L-organizzazzjoni ta' ringieli radjali u l-lokalizzazzjoni taċ-ċelloli IPR bejn organi suċċessivi jissuġġerixxu li dawn iċ-ċelloli huma progenituri internodali.
Hawnhekk, żviluppajna bijosensur tas-sinjalar GA razzometriku, qmRGA, li jippermetti mmappjar kwantitattiv tal-attività tas-sinjalar GA li tirriżulta minn konċentrazzjonijiet kombinati ta' GA u riċetturi GA filwaqt li jimminimizza l-interferenza mal-mogħdijiet tas-sinjalar endoġeni, u b'hekk jipprovdi informazzjoni dwar il-funzjoni GA fil-livell ċellulari. Għal dan il-għan, bnejna proteina DELLA modifikata, mRGA, li tilfet il-kapaċità li torbot mas-sħab ta' interazzjoni DELLA iżda tibqa' sensittiva għall-proteoliżi indotta minn GA. qmRGA tirrispondi kemm għal bidliet eżoġeni kif ukoll endoġeni fil-livelli GA, u l-proprjetajiet ta' sensing dinamiku tagħha jippermettu valutazzjoni ta' bidliet spatiotemporali fl-attività tas-sinjalar GA waqt l-iżvilupp. qmRGA hija wkoll għodda flessibbli ħafna peress li tista' tiġi adattata għal tessuti differenti billi jinbidel il-promotur użat għall-espressjoni tagħha (jekk meħtieġ), u minħabba n-natura konservata tal-mogħdija tas-sinjalar GA u l-motiv PFYRE fl-anġjospermi kollha, x'aktarx li tkun trasferibbli għal speċi oħra22. Konsistenti ma' dan, mutazzjoni ekwivalenti fil-proteina SLR1 DELLA tar-ross (HYY497AAA) intweriet ukoll li trażżan l-attività tar-ripressur tat-tkabbir ta' SLR1 filwaqt li naqqset biss ftit id-degradazzjoni medjata mill-GA tagħha, simili għal mRGA23. Notevolment, studji reċenti f'Arabidopsis urew li mutazzjoni ta' aċidu amminiku wieħed fid-dominju PFYRE (S474L) biddlet l-attività traskrizzjonali ta' RGA mingħajr ma affettwat il-kapaċità tagħha li tinteraġixxi ma' sħab tal-fatturi ta' traskrizzjoni50. Għalkemm din il-mutazzjoni hija qrib ħafna tat-3 sostituzzjonijiet ta' aċidu amminiku preżenti f'mRGA, l-istudji tagħna juru li dawn iż-żewġ mutazzjonijiet ibiddlu karatteristiċi distinti ta' DELLA. Għalkemm ħafna sħab tal-fatturi ta' traskrizzjoni jorbtu mad-dominji LHR1 u SAW ta' DELLA26,51, xi aminoaċidi konservati fid-dominju PFYRE jistgħu jgħinu biex jistabbilizzaw dawn l-interazzjonijiet.
L-iżvilupp tal-internodu huwa karatteristika ewlenija fl-arkitettura tal-pjanti u fit-titjib tar-rendiment. qmRGA żvela attività ogħla ta' sinjalar GA fiċ-ċelloli progenituri tal-internodu tal-IPR. Billi kkombinajna immaġini kwantitattivi u l-ġenetika, wrejna li x-xejriet ta' sinjalar GA jissuperimponu pjanijiet ċirkolari/trasversali tad-diviżjoni taċ-ċelloli fl-epidermide SAM, u jsawru l-organizzazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelloli meħtieġa għall-iżvilupp tal-internodu. Diversi regolaturi tal-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelloli ġew identifikati matul l-iżvilupp52,53. Ix-xogħol tagħna jipprovdi eżempju ċar ta' kif l-attività ta' sinjalar GA tirregola dan il-parametru ċellulari. DELLA jista' jinteraġixxi ma' kumplessi ta' proteini li jintwew minn qabel41, għalhekk is-sinjalar GA jista' jirregola l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelloli billi jinfluwenza direttament l-orjentazzjoni tal-mikrotubuli kortikali40,41,54,55. B'mod mhux mistenni wrejna li fis-SAM, il-korrelat ta' attività ogħla ta' sinjalar GA ma kienx it-titwil jew id-diviżjoni taċ-ċelloli, iżda biss l-anisotropija tat-tkabbir, li hija konsistenti ma' effett dirett tal-GA fuq id-direzzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelloli fl-IPR. Madankollu, ma nistgħux neskludu li dan l-effett jista' jkun ukoll indirett, pereżempju medjat minn trattib tal-ħajt taċ-ċelloli indott mill-GA56. Tibdil fil-proprjetajiet tal-ħajt taċ-ċellula jikkaġuna stress mekkaniku57,58, li jista' jinfluwenza wkoll l-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċellula billi jaffettwa l-orjentazzjoni tal-mikrotubuli kortikali39,46,59. L-effetti kkombinati tal-istress mekkaniku indott mill-GA u r-regolazzjoni diretta tal-orjentazzjoni tal-mikrotubuli mill-GA jistgħu jkunu involuti fil-ġenerazzjoni ta' mudell speċifiku ta' orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċellula fl-IPR biex jiddefinixxu l-internodi, u huma meħtieġa aktar studji biex tiġi ttestjata din l-idea. Bl-istess mod, studji preċedenti enfasizzaw l-importanza tal-proteini TCP14 u 15 li jinteraġixxu mad-DELLA fil-kontroll tal-formazzjoni tal-internodi60,61 u dawn il-fatturi jistgħu jimmedjaw l-azzjoni tal-GA flimkien ma' BREVIPEDICELLUS (BP) u PENNYWISE (PNY), li jirregolaw l-iżvilupp tal-internodi u ntwera li jinfluwenzaw is-sinjalar tal-GA2,62. Minħabba li d-DELLAs jinteraġixxu ma' mogħdijiet ta' sinjalazzjoni ta' brassinosterojdi, etilene, aċidu jasmonik, u aċidu absċisiku (ABA)63,64 u li dawn l-ormoni jistgħu jinfluwenzaw l-orjentazzjoni tal-mikrotubuli65, l-effetti tal-GA fuq l-orjentazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli jistgħu wkoll ikunu medjati minn ormoni oħra.
Studji ċitoloġiċi bikrija wrew li kemm ir-reġjuni ta’ ġewwa kif ukoll ta’ barra tas-SAM ta’ Arabidopsis huma meħtieġa għall-iżvilupp tal-internodu2,42. Il-fatt li l-GA jirregola b’mod attiv id-diviżjoni taċ-ċelluli fit-tessuti ta’ ġewwa12 jappoġġja funzjoni doppja tal-GA fir-regolazzjoni tad-daqs tal-meristem u tal-internodu fis-SAM. Ix-xejra tad-diviżjoni direzzjonali taċ-ċelluli hija wkoll regolata sew fit-tessut tas-SAM ta’ ġewwa, u din ir-regolazzjoni hija essenzjali għat-tkabbir taz-zokk52. Se jkun interessanti li jiġi eżaminat jekk il-GA għandhiex ukoll rwol fl-orjentazzjoni tal-pjan tad-diviżjoni taċ-ċelluli fl-organizzazzjoni tas-SAM ta’ ġewwa, u b’hekk tissinkronizza l-ispeċifikazzjoni u l-iżvilupp tal-internodi fi ħdan is-SAM.
Il-pjanti tkabbru in vitro fil-ħamrija jew f'mezz 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) supplimentat b'1% sukrożju u 1% agar (Sigma) taħt kundizzjonijiet standard (16 siegħa dawl, 22 °C), ħlief għal esperimenti tat-tkabbir tal-ipokotil u tal-għeruq fejn in-nebbieta tkabbru fuq pjanċi vertikali taħt dawl kostanti u 22 °C. Għal esperimenti tan-nitrat, il-pjanti tkabbru fuq mezz MS modifikat (mezz tal-pjanti bioWORLD) supplimentat b'nitrat adegwat (0 jew 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sukrożju u 1% A-agar (Sigma) taħt kundizzjonijiet ta' ġurnata twila.
Is-cDNA ta' GID1a mdaħħal f'pDONR221 ġie rikombinat ma' pDONR P4-P1R-pUBQ10 u pDONR P2R-P3-mCherry f'pB7m34GW biex jiġġenera pUBQ10::GID1a-mCherry. Id-DNA ta' IDD2 mdaħħal f'pDONR221 ġie rikombinat f'pB7RWG266 biex jiġġenera p35S:IDD2-RFP. Biex jiġi ġġenerat pGID1b::2xmTQ2-GID1b, framment ta' 3.9 kb 'il fuq mir-reġjun tal-kodifikazzjoni GID1b u framment ta' 4.7 kb li fih is-cDNA GID1b (1.3 kb) u t-terminatur (3.4 kb) ġew l-ewwel amplifikati bl-użu tal-primers fit-Tabella Supplimentari 3 u mbagħad imdaħħla f'pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) u pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), rispettivament, u finalment rikkombinati ma' pDONR221 2xmTQ268 fil-vettur fil-mira pGreen 012567 bl-użu tal-ikklonjar Gateway. Biex tiġi ġġenerata pCUC2::LSSmOrange, is-sekwenza tal-promotur CUC2 (3229 bp 'il fuq minn ATG) segwita mis-sekwenza tal-kodifikazzjoni ta' mOrange kbir imċaqlaq minn Stokes (LSSmOrange)69 bis-sinjal tal-lokalizzazzjoni nukleari N7 u t-terminatur traskrizzjonali NOS ġew immuntati fil-vettur tal-mira tal-kanamycin pGreen bl-użu tas-sistema ta' rikombinazzjoni ta' 3 frammenti Gateway (Invitrogen). Il-vettur binarju tal-pjanti ġie introdott fir-razza GV3101 ta' Agrobacterium tumefaciens u introdott fil-weraq ta' Nicotiana benthamiana permezz tal-metodu ta' infiltrazzjoni ta' Agrobacterium u f'Arabidopsis thaliana Col-0 permezz tal-metodu ta' dip tal-fjuri, rispettivament. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry u pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ġew iżolati mill-proġeni F3 u F1 tat-taħlitiet rispettivi, rispettivament.
L-ibridizzazzjoni in situ tal-RNA twettqet fuq ponot tar-rimjiet ta' madwar 1 ċm twal72, li nġabru u ġew iffissati immedjatament f'soluzzjoni FAA (3.7% formaldehyde, 5% aċidu aċetiku, 50% etanol) imkessħa minn qabel għal 4 °C. Wara trattamenti bil-vakwu ta' 2 × 15-il minuta, il-fissattiv inbidel u l-kampjuni ġew inkubati matul il-lejl. Is-cDNAs ta' GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, u RGL3 u s-sondi antisens għat-3′-UTRs tagħhom ġew sintetizzati bl-użu tal-primers murija fit-Tabella Supplimentari 3 kif deskritt minn Rosier et al.73. Sondi mmarkati bid-digoxigenin ġew immunodetetti bl-użu ta' antikorpi tad-digoxigenin (dilwizzjoni ta' 3000 darba; Roche, numru tal-katalogu: 11 093 274 910), u s-sezzjonijiet ġew imtebbgħin b'soluzzjoni ta' 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, dilwizzjoni ta' 250 darba)/nitroblue tetrazolium (NBT, dilwizzjoni ta' 200 darba).
Ħin tal-posta: 10 ta' Frar 2025