Il-proteini DELLA huma kkonservatiregolaturi tat-tkabbirli għandhom rwol ċentrali fl-iżvilupp tal-pjanti b'reazzjoni għal sinjali interni u esterni. Bħala regolaturi tat-traskrizzjoni, id-DELLAs jorbtu ma' fatturi ta' traskrizzjoni (TFs) u l-istone H2A permezz tad-dominji GRAS tagħhom u huma reklutati biex jaġixxu fuq il-promoturi. Studji reċenti wrew li l-istabbiltà tad-DELLA hija regolata wara t-traduzzjoni minn żewġ mekkaniżmi: il-polyubiquitination indotta mill-ormon tal-pjantiġibberellina, li jwassal għad-degradazzjoni rapida tagħhom, u l-konjugazzjoni ma' modifikatur żgħir simili għall-ubiquitin (SUMO), li jżid l-akkumulazzjoni tagħhom. Barra minn hekk, l-attività ta' DELLA hija regolata b'mod dinamiku minn żewġ mekkaniżmi distinti ta' glikosilazzjoni: L-O-fukosilazzjoni ssaħħaħ l-interazzjoni DELLA-TF, filwaqt li l-modifika ta' N-aċetilglukosamina marbuta ma' O (O-GlcNAc) tinibixxi l-interazzjoni DELLA-TF. Madankollu, ir-rwol tal-fosforilazzjoni ta' DELLA mhux ċar peress li studji preċedenti wrew riżultati konfliġġenti, b'xi wħud jissuġġerixxu li l-fosforilazzjoni tippromwovi jew trażżan id-degradazzjoni ta' DELLA u oħrajn jissuġġerixxu li l-fosforilazzjoni ma taffettwax l-istabbiltà tagħhom. Hawnhekk, nidentifikaw siti ta' fosforilazzjoni fir-repressur GA1-3 (RGA), AtDELLA, purifikat minn Arabidopsis thaliana permezz ta' spettrometrija tal-massa u nuru li l-fosforilazzjoni ta' żewġ peptidi RGA fir-reġjuni PolyS u PolyS/T ssaħħaħ l-attività RGA billi tippromwovi l-irbit ta' H2A u l-assoċjazzjoni RGA mal-promoturi fil-mira. Ta' min jinnota li l-fosforilazzjoni ma affettwatx l-interazzjonijiet RGA-TF jew l-istabbiltà RGA. L-istudju tagħna jiżvela mekkaniżmu molekulari li bih il-fosforilazzjoni tinduċi l-attività tad-DELLA.
L-analiżi spettrometrika tal-massa tagħna żvelat li kemm Pep1 kif ukoll Pep2 kienu fosforilati ħafna f'RGA fl-isfond ta' Ga1 b'defiċjenza ta' GA. Minbarra dan l-istudju, studji fosfoproteomiċi żvelaw ukoll fosforilazzjoni ta' Pep1 f'RGA, għalkemm ir-rwol tagħha għadu ma ġiex studjat53,54,55. B'kuntrast, il-fosforilazzjoni ta' Pep2 ma ġietx deskritta qabel peress li dan il-peptide seta' jiġi skopert biss bl-użu tat-transġene RGAGKG. Għalkemm il-mutazzjoni m1A, li abolixxiet il-fosforilazzjoni ta' Pep1, naqqset biss ftit l-attività ta' RGA fil-pjanta, kellha effett addittiv meta kkombinata ma' m2A fit-tnaqqis tal-attività ta' RGA (Figura Supplimentari 6). Importanti, il-fosforilazzjoni ta' Pep1 tnaqqset b'mod sinifikanti fil-mutant sly1 imtejjeb bil-GA meta mqabbel ma' ga1, li jissuġġerixxi li GA jippromwovi d-defosforilazzjoni ta' RGA, u b'hekk inaqqas l-attività tiegħu. Il-mekkaniżmu li bih GA jrażżan il-fosforilazzjoni ta' RGA jeħtieġ aktar investigazzjoni. Possibbiltà waħda hija li dan jinkiseb permezz tar-regolazzjoni ta' proteina kinażi mhux identifikata. Għalkemm studji wrew li l-espressjoni tal-kinażi tal-proteina CK1 EL1 hija regolata 'l isfel minn GA fir-ross41, ir-riżultati tagħna jindikaw li mutazzjonijiet ta' ordni ogħla tal-omologu ta' Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ma jnaqqsux il-fosforilazzjoni tal-RGA. Fi qbil mar-riżultati tagħna, studju fosfoproteomiku reċenti bl-użu ta' linji li jesprimu żżejjed lil Arabidopsis AEL u mutant triplu ael ma identifika l-ebda proteini DELLA bħala sottostrati ta' dawn il-kinażi56. Meta ħejjejna l-manuskritt, ġie rrappurtat li GSK3, il-ġene li jikkodifika kinażi simili għal GSK3/SHAGGY fil-qamħ (Triticum aestivum), jista' jiffosforila DELLA (Rht-B1b)57, għalkemm il-fosforilazzjoni ta' Rht-B1b minn GSK3 ma ġietx ikkonfermata fil-pjanti. Reazzjonijiet enżimatiċi in vitro fil-preżenza ta' GSK3 segwiti minn analiżi tal-ispettrometrija tal-massa żvelaw tliet siti ta' fosforilazzjoni li jinsabu bejn id-dominji DELLA u GRAS ta' Rht-B1b (Fig. Supplimentari 3). Sostituzzjonijiet ta' serina għal alanina fit-tliet siti ta' fosforilazzjoni rriżultaw fi tnaqqis fl-attività ta' Rht-B1b fil-qamħ transġeniku, konsistenti mas-sejbiet tagħna li s-sostituzzjonijiet tal-alanina f'Pep2 RGA naqqsu l-attività ta' RGA. Madankollu, assays ta' degradazzjoni tal-proteini in vitro wrew aktar li l-fosforilazzjoni tista' wkoll tistabbilizza Rht-B1b57. Dan huwa f'kuntrast mar-riżultati tagħna li juru li s-sostituzzjonijiet tal-alanina f'Pep2 RGA ma jbiddlux l-istabbiltà tiegħu fil-pjanti. GSK3 fil-qamħ huwa ortologu tal-proteina 2 li ma tixxennaqx għall-brassinosteroids (BIN2) f'Arabidopsis 57. BIN2 huwa regolatur negattiv tas-sinjalar BR, u BR jattiva l-mogħdija tas-sinjalar tiegħu billi jikkawża degradazzjoni ta' BIN2 58. Urejna li t-trattament BR ma jnaqqasx l-istabbiltà ta' RGA 59 jew il-livelli ta' fosforilazzjoni f'Arabidopsis (Figura Supplimentari 2), li jissuġġerixxi li RGA x'aktarx ma jiġix fosforilat minn BIN2.
Id-dejta kwantitattiva kollha ġiet analizzata statistikament bl-użu tal-Excel, u d-differenzi sinifikanti ġew determinati bl-użu tat-test-t tal-Istudent. Ma ntużaw l-ebda metodi statistiċi biex jiġi predeterminat id-daqs tal-kampjun. L-ebda dejta ma ġiet eskluża mill-analiżi; l-esperiment ma kienx każwali; u r-riċerkaturi kienu konxji tal-allokazzjoni matul l-esperiment u l-valutazzjoni tar-riżultati. Id-daqsijiet tal-kampjuni huma pprovduti fil-leġġendi tal-figuri u fil-fajls tad-dejta mhux ipproċessata.
Ħin tal-posta: 15 ta' April 2025