Il-proteini DELLA huma kkonservatiregolaturi tat-tkabbirli għandhom rwol ċentrali fl-iżvilupp tal-pjanti b'reazzjoni għal sinjali interni u esterni. Bħala regolaturi tat-traskrizzjoni, DELLAs jorbtu ma 'fatturi ta' traskrizzjoni (TFs) u histone H2A permezz tad-dominji GRAS tagħhom u huma rreklutati biex jaġixxu fuq il-promoturi. Studji reċenti wrew li l-istabbiltà DELLA hija regolata wara t-traduzzjoni b'żewġ mekkaniżmi: polyubiquitination indotta mill-ormon tal-pjantigiberellin, li jwassal għad-degradazzjoni mgħaġġla tagħhom, u konjugazzjoni b'modifikatur żgħir bħal ubiquitin (SUMO), li jżid l-akkumulazzjoni tagħhom. Barra minn hekk, l-attività DELLA hija regolata b'mod dinamiku minn żewġ mekkaniżmi distinti ta 'glycosylation: O-fucosylation ittejjeb l-interazzjoni DELLA-TF, filwaqt li l-modifika N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) marbuta ma' O tinibixxi l-interazzjoni DELLA-TF. Madankollu, ir-rwol tal-fosforilazzjoni DELLA mhuwiex ċar peress li studji preċedenti wrew riżultati konfliġġenti, b'xi wħud jissuġġerixxu li l-fosforilazzjoni tippromwovi jew trażżan id-degradazzjoni DELLA u oħrajn jissuġġerixxu li l-fosforilazzjoni ma taffettwax l-istabbiltà tagħhom. Hawnhekk, aħna nidentifikaw siti ta 'fosforilazzjoni fir-repressor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purifikat minn Arabidopsis thaliana permezz ta' spettrometrija tal-massa u nuru li l-fosforilazzjoni ta 'żewġ peptidi RGA fir-reġjuni PolyS u PolyS/T ittejjeb l-attività RGA billi tippromwovi rabta ta' H2A u assoċjazzjoni RGA ma 'promoturi fil-mira. Notevolment, il-fosforilazzjoni ma affettwax l-interazzjonijiet RGA-TF jew l-istabbiltà RGA. L-istudju tagħna jiżvela mekkaniżmu molekulari li bih il-fosforilazzjoni tinduċi attività DELLA.
L-analiżi spettrometrika tal-massa tagħna wriet li kemm Pep1 kif ukoll Pep2 kienu fosforilati ħafna f'RGA fl-isfond Ga1 defiċjenti ta 'GA. Minbarra dan l-istudju, studji fosfoproteomiċi wrew ukoll fosforilazzjoni Pep1 f'RGA, għalkemm ir-rwol tiegħu għadu ma ġiex studjat53,54,55. B'kuntrast, il-fosforilazzjoni Pep2 ma ġietx deskritta qabel peress li dan il-peptide seta' jiġi skopert biss bl-użu tat-transġene RGAGKG. Għalkemm il-mutazzjoni m1A, li abolit il-fosforilazzjoni Pep1, naqqset biss ftit l-attività RGA fil-pjanta, kellha effett addittiv meta kkombinata ma 'm2A fit-tnaqqis tal-attività RGA (Figura 6 Supplimentari). Importanti, il-fosforilazzjoni ta 'Pep1 tnaqqset b'mod sinifikanti fil-mutant sly1 imtejjeb b'GA meta mqabbel ma' ga1, li jissuġġerixxi li GA jippromwovi defosforilazzjoni RGA, u jnaqqas l-attività tiegħu. Il-mekkaniżmu li bih GA jrażżan il-fosforilazzjoni RGA jeħtieġ aktar investigazzjoni. Possibbiltà waħda hija li dan jinkiseb permezz tar-regolamentazzjoni ta 'protein kinase mhux identifikat. Għalkemm studji wrew li l-espressjoni tal-proteina CK1 kinase EL1 hija regolata 'l isfel minn GA fir-ross41, ir-riżultati tagħna jindikaw li mutazzjonijiet ta' ordni ogħla tal-omologu Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ma jnaqqsux il-fosforilazzjoni RGA. Bi qbil mar-riżultati tagħna, studju fosfoproteomiku riċenti li juża linji ta 'espressjoni żejda ta' Arabidopsis AEL u mutant triplu ael ma identifika l-ebda proteini DELLA bħala sottostrati ta 'dawn kinases56. Meta ħejjejna l-manuskritt, ġie rrappurtat li GSK3, il-ġene li jikkodifika kinase simili għal GSK3/SHAGGY fil-qamħ (Triticum aestivum), jista 'fosforilat DELLA (Rht-B1b)57, għalkemm il-fosforilazzjoni ta' Rht-B1b minn GSK3 ma ġietx ikkonfermata fil-planta. Reazzjonijiet enżimatiċi in vitro fil-preżenza ta 'GSK3 segwiti minn analiżi ta' spettrometrija tal-massa żvelaw tliet siti ta 'fosforilazzjoni li jinsabu bejn id-dominji DELLA u GRAS ta' Rht-B1b (Fig. 3 Supplimentari). Sostituzzjonijiet ta 'serine għal alanine fit-tliet siti ta' fosforilazzjoni kollha rriżultaw f'attività Rht-B1b mnaqqsa fil-qamħ transġeniku, konsistenti mas-sejbiet tagħna li s-sostituzzjonijiet ta 'alanine f'Pep2 RGA naqsu l-attività RGA. Madankollu, testijiet ta 'degradazzjoni tal-proteini in vitro wrew aktar li l-fosforilazzjoni tista' tistabbilizza wkoll Rht-B1b57. Dan huwa b'kuntrast mar-riżultati tagħna li juru li s-sostituzzjonijiet tal-alanine f'Pep2 RGA ma jbiddlux l-istabbiltà tiegħu fil-planta. GSK3 fil-qamħ huwa ortholog tal-proteina 2 insensittiva għall-brassinosterojdi (BIN2) f'Arabidopsis 57. BIN2 huwa regolatur negattiv tas-sinjalar tal-BR, u BR jattiva l-mogħdija tas-sinjalar tiegħu billi jikkawża degradazzjoni BIN2 58. Aħna wrejna li t-trattament tal-BR ma jnaqqasx l-istabbiltà tal-RGA 59 jew il-livelli ta 'fosforilazzjoni 59 jew phosphorylation li jissuġġerixxu l-livelli ta' Arabi2 (Supplementary GA) mhux probabbli li jiġi fosforilat minn BIN2.
Id-dejta kwantitattiva kollha ġiet analizzata statistikament bl-użu ta 'Excel, u d-differenzi sinifikanti ġew determinati bl-użu tat-test t ta' Student. L-ebda metodu statistiku ma ntuża biex jiġi ddeterminat minn qabel id-daqs tal-kampjun. L-ebda data ma ġiet eskluża mill-analiżi; l-esperiment ma kienx randomised; u r-riċerkaturi kienu konxji tal-allokazzjoni matul l-esperiment u l-valutazzjoni tar-riżultat. Daqsijiet tal-kampjun huma pprovduti fil-leġġendi tal-figura u fil-fajls tad-dejta mhux ipproċessata.
Ħin tal-post: Apr-15-2025