Dan l-istudju vvaluta l-letalità, is-subletalità, u t-tossiċità ta' prodotti kummerċjaliċipermetrinaformulazzjonijiet għal girwież tal-anuran. Fit-test akut, ġew ittestjati konċentrazzjonijiet ta’ 100–800 μg/L għal 96 siegħa. Fit-test kroniku, ġew ittestjati konċentrazzjonijiet ta’ cypermethrin li jseħħu b’mod naturali (1, 3, 6, u 20 μg/L) għall-mortalità, segwiti minn testijiet tal-mikronukleu u anormalitajiet nukleari taċ-ċelluli ħomor tad-demm għal 7 ijiem. L-LC50 tal-formulazzjoni kummerċjali ta’ cypermethrin għal girwież kienet ta’ 273.41 μg L−1. Fit-test kroniku, l-ogħla konċentrazzjoni (20 μg L−1) irriżultat f’mortalità ta’ aktar minn 50%, peress li qatlet nofs il-girwież ittestjati. It-test tal-mikronukleu wera riżultati sinifikanti f’6 u 20 μg L−1 u ġew skoperti diversi anormalitajiet nukleari, li jindika li l-formulazzjoni kummerċjali ta’ cypermethrin għandha potenzjal ġenotossiku kontra P. gracilis. Iċ-cypermethrin hija ta’ riskju għoli għal din l-ispeċi, li jindika li tista’ tikkawża problemi multipli u taffettwa d-dinamika ta’ din l-ekosistema fuq medda qasira u twila ta’ żmien. Għalhekk, jista' jiġi konkluż li l-formulazzjonijiet kummerċjali taċ-ċipermetrina għandhom effetti tossiċi fuq P. gracilis.
Minħabba l-espansjoni kontinwa tal-attivitajiet agrikoli u l-applikazzjoni intensiva ta'kontroll tal-pestiF'miżuri oħra, l-annimali akkwatiċi huma ta' spiss esposti għall-pestiċidi1,2. It-tniġġis tar-riżorsi tal-ilma ħdejn l-għelieqi agrikoli jista' jaffettwa l-iżvilupp u s-sopravivenza ta' organiżmi mhux fil-mira bħall-anfibji.
L-anfibji qed isiru dejjem aktar importanti fil-valutazzjoni tal-matriċi ambjentali. L-anurani huma kkunsidrati bħala bijoindikaturi tajbin ta’ sustanzi niġġiesa ambjentali minħabba l-karatteristiċi uniċi tagħhom bħal ċikli tal-ħajja kumplessi, rati ta’ tkabbir rapidi tal-larva, status trofiku, ġilda permeabbli10,11, dipendenza fuq l-ilma għar-riproduzzjoni12 u bajd mhux protett11,13,14. Iż-żrinġ żgħir tal-ilma (Physalaemus gracilis), magħruf komunement bħala ż-żrinġ imbeżża’, intwera li huwa speċi bijoindikatur tat-tniġġis mill-pestiċidi4,5,6,7,15. L-ispeċi tinstab f’ilmijiet wieqfa, żoni protetti jew żoni b’ħabitat varjabbli fl-Arġentina, l-Urugwaj, il-Paragwaj u l-Brażil1617 u hija kkunsidrata stabbli mill-klassifikazzjoni tal-IUCN minħabba d-distribuzzjoni wiesgħa tagħha u t-tolleranza ta’ ħabitats differenti18.
Ġew irrappurtati effetti subletali fl-anfibji wara espożizzjoni għaċ-ċipermetrina, inklużi bidliet fl-imġieba, morfoloġiċi u bijokimiċi fit-tarzni23,24,25, mortalità mibdula u ħin tal-metamorfożi, bidliet enżimatiċi, tnaqqis fis-suċċess tat-tfaqqis24,25, iperattività26, inibizzjoni tal-attività tal-kolinesterażi27 u bidliet fil-prestazzjoni tal-għawm7,28. Madankollu, studji dwar l-effetti ġenotossiċi taċ-ċipermetrina fl-anfibji huma limitati. Għalhekk, huwa importanti li tiġi vvalutata s-suxxettibilità tal-ispeċi tal-anurani għaċ-ċipermetrina.
It-tniġġis ambjentali jaffettwa t-tkabbir u l-iżvilupp normali tal-anfibji, iżda l-aktar effett avvers serju huwa l-ħsara ġenetika lid-DNA kkawżata mill-espożizzjoni għall-pestiċidi13. L-analiżi tal-morfoloġija taċ-ċelluli tad-demm hija bijoindikatur importanti tat-tniġġis u t-tossiċità potenzjali ta’ sustanza għall-ispeċi selvaġġi29. It-test tal-mikronukleu huwa wieħed mill-aktar metodi użati komunement biex tiġi ddeterminata l-ġenotossiċità tal-kimiċi fl-ambjent30. Huwa metodu rapidu, effettiv u rħis li huwa indikatur tajjeb tat-tniġġis kimiku ta’ organiżmi bħall-anfibji31,32 u jista’ jipprovdi informazzjoni dwar l-espożizzjoni għal sustanzi niġġiesa ġenotossiċi33.
L-għan ta’ dan l-istudju kien li jevalwa l-potenzjal tossiku tal-formulazzjonijiet kummerċjali taċ-ċipermetrina għal girwiel akkwatiċi żgħar bl-użu ta’ test tal-mikronukleu u valutazzjoni tar-riskju ekoloġiku.
Mortalità kumulattiva (%) ta' girwiel ta' P. gracilis esposti għal konċentrazzjonijiet differenti ta' cypermethrin kummerċjali matul il-perjodu akut tat-test.
Mortalità kumulattiva (%) ta' girwiel ta' P. gracilis esposti għal konċentrazzjonijiet differenti ta' ċipermetrina kummerċjali waqt test kroniku.
Il-mortalità għolja osservata kienet riżultat ta' effetti ġenotossiċi f'anfibji esposti għal konċentrazzjonijiet differenti ta' cypermethrin (6 u 20 μg/L), kif evidenzjat mill-preżenza ta' mikronuklei (MN) u anormalitajiet nukleari fl-eritroċiti. Il-formazzjoni ta' MN tindika żbalji fil-mitożi u hija assoċjata ma' twaħħil ħażin tal-kromożomi mal-mikrotubuli, difetti f'kumplessi ta' proteini responsabbli għall-assorbiment u t-trasport tal-kromożomi, żbalji fis-segregazzjoni tal-kromożomi u żbalji fit-tiswija tal-ħsara fid-DNA38,39 u tista' tkun relatata ma' stress ossidattiv ikkaġunat mill-pestiċidi40,41. Anormalitajiet oħra ġew osservati fil-konċentrazzjonijiet kollha evalwati. Iż-żieda fil-konċentrazzjonijiet ta' cypermethrin żiedet l-anormalitajiet nukleari fl-eritroċiti b'5% u 20% fl-aktar dożi baxxi (1 μg/L) u l-ogħla (20 μg/L), rispettivament. Pereżempju, bidliet fid-DNA ta' speċi jista' jkollhom konsegwenzi serji kemm għas-sopravivenza fuq medda qasira kif ukoll twila ta' żmien, li jirriżultaw fi tnaqqis fil-popolazzjoni, kundizzjoni riproduttiva mibdula, tnissil bejn individwi, telf ta' diversità ġenetika, u rati ta' migrazzjoni mibdula. Dawn il-fatturi kollha jistgħu jkollhom impatt fuq is-sopravivenza u ż-żamma tal-ispeċi42,43. Il-formazzjoni ta' anormalitajiet eritrojdi tista' tindika imblokk fiċ-ċitokineżi, li jirriżulta f'diviżjoni anormali taċ-ċelluli (eritroċiti binukleati)44,45; nuklei multilobati huma sporġenzi tal-membrana nukleari b'lobi multipli46, filwaqt li anormalitajiet eritrojdi oħra jistgħu jkunu assoċjati ma' amplifikazzjoni tad-DNA, bħal kliewi/vesigħat nukleari47. Il-preżenza ta' eritroċiti anukleati tista' tindika trasport indebolit tal-ossiġnu, speċjalment f'ilma kkontaminat48,49. L-apoptożi tindika mewt taċ-ċelluli50.
Studji oħra wrew ukoll l-effetti ġenotossiċi taċ-ċipermetrina. Kabaña et al.51 urew il-preżenza ta’ mikronuklei u bidliet nukleari bħal ċelloli binukleati u ċelloli apoptotiċi fiċ-ċelloli ta’ Odontophrynus americanus wara espożizzjoni għal konċentrazzjonijiet għoljin ta’ ċipermetrina (5000 u 10,000 μg L−1) għal 96 siegħa. Apoptożi indotta miċ-ċipermetrina ġiet skoperta wkoll f’P. biligonigerus52 u Rhinella arenarum53. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li ċ-ċipermetrina għandha effetti ġenotossiċi fuq firxa ta’ organiżmi akkwatiċi u li l-assaġġ MN u ENA jista’ jkun indikatur ta’ effetti subletali fuq l-anfibji u jista’ jkun applikabbli għal speċi indiġeni u popolazzjonijiet selvaġġi esposti għal tossikanti12.
Il-formulazzjonijiet kummerċjali taċ-ċipermetrina joħolqu periklu ambjentali għoli (kemm akut kif ukoll kroniku), b'HQs li jaqbżu l-livell tal-Aġenzija tal-Protezzjoni Ambjentali tal-Istati Uniti (EPA)54 li jistgħu jaffettwaw ħażin l-ispeċi jekk ikunu preżenti fl-ambjent. Fil-valutazzjoni tar-riskju kroniku, l-NOEC għall-mortalità kien ta' 3 μg L−1, li jikkonferma li l-konċentrazzjonijiet misjuba fl-ilma jistgħu joħolqu riskju għall-ispeċi55. L-NOEC letali għal-larva ta' R. arenarum esposta għal taħlita ta' endosulfan u ċipermetrina kien ta' 500 μg L−1 wara 168 siegħa; dan il-valur naqas għal 0.0005 μg L−1 wara 336 siegħa. L-awturi juru li iktar ma tkun twila l-espożizzjoni, iktar ikunu baxxi l-konċentrazzjonijiet li huma ta' ħsara għall-ispeċi. Huwa importanti wkoll li jiġi enfasizzat li l-valuri tal-NOEC kienu ogħla minn dawk ta' P. gracilis fl-istess ħin ta' espożizzjoni, li jindika li r-rispons tal-ispeċi għaċ-ċipermetrina huwa speċifiku għall-ispeċi. Barra minn hekk, f'termini ta' mortalità, il-valur CHQ ta' P. gracilis wara l-espożizzjoni għal cypermethrin laħaq 64.67, li huwa ogħla mill-valur ta' referenza stabbilit mill-Aġenzija tal-Protezzjoni Ambjentali tal-Istati Uniti54, u l-valur CHQ tal-larva ta' R. arenarum kien ukoll ogħla minn dan il-valur (CHQ > 388.00 wara 336 siegħa), li jindika li l-insettiċidi studjati joħolqu riskju għoli għal diversi speċi ta' anfibji. Meta wieħed iqis li P. gracilis jeħtieġ madwar 30 jum biex jikkompleta l-metamorfożi56, jista' jiġi konkluż li l-konċentrazzjonijiet studjati ta' cypermethrin jistgħu jikkontribwixxu għat-tnaqqis fil-popolazzjoni billi jipprevjenu lill-individwi infettati milli jidħlu fl-istadju adult jew riproduttiv f'età żgħira.
Fil-valutazzjoni kkalkulata tar-riskju tal-mikronuklei u anormalitajiet nukleari oħra tal-eritroċiti, il-valuri tas-CHQ varjaw minn 14.92 sa 97.00, u dan jindika li ċ-ċipermetrina kellha riskju ġenotossiku potenzjali għal P. gracilis anke fl-ħabitat naturali tagħha. Meta titqies il-mortalità, il-konċentrazzjoni massima ta' komposti ksenobijotiċi tollerabbli għal P. gracilis kienet ta' 4.24 μg L−1. Madankollu, konċentrazzjonijiet baxxi daqs 1 μg/L urew ukoll effetti ġenotossiċi. Dan il-fatt jista' jwassal għal żieda fin-numru ta' individwi anormali57 u jaffettwa l-iżvilupp u r-riproduzzjoni tal-ispeċi fl-ħabitats tagħhom, u dan iwassal għal tnaqqis fil-popolazzjonijiet tal-anfibji.
Formulazzjonijiet kummerċjali tal-insettiċida cypermethrin urew tossiċità akuta u kronika għolja għal P. gracilis. Ġew osservati rati ta' mortalità ogħla, x'aktarx minħabba effetti tossiċi, kif evidenzjat mill-preżenza ta' anormalitajiet nukleari tal-mikronuklei u tal-eritroċiti, speċjalment nuklei bis-snien, nuklei lobati, u nuklei vesikulari. Barra minn hekk, l-ispeċi studjati wrew riskji ambjentali akbar, kemm akuti kif ukoll kroniċi. Din id-dejta, flimkien ma' studji preċedenti mill-grupp ta' riċerka tagħna, uriet li anke formulazzjonijiet kummerċjali differenti ta' cypermethrin xorta kkawżaw tnaqqis fl-attivitajiet tal-acetylcholinesterase (AChE) u tal-butyrylcholinesterase (BChE) u stress ossidattiv58, u rriżultaw f'bidliet fl-attività tal-għawm u malformazzjonijiet orali59 f'P. gracilis, li jindika li l-formulazzjonijiet kummerċjali ta' cypermethrin għandhom tossiċità letali u subletali għolja għal din l-ispeċi. Hartmann et al. 60 sabu li l-formulazzjonijiet kummerċjali ta' cypermethrin kienu l-aktar tossiċi għal P. gracilis u speċi oħra tal-istess ġeneru (P. cuvieri) meta mqabbla ma' disa' pestiċidi oħra. Dan jissuġġerixxi li konċentrazzjonijiet ta' cypermethrin approvati legalment għall-protezzjoni ambjentali jistgħu jirriżultaw f'mortalità għolja u tnaqqis fil-popolazzjoni fit-tul.
Huma meħtieġa aktar studji biex tiġi vvalutata t-tossiċità tal-pestiċida għall-anfibji, peress li l-konċentrazzjonijiet misjuba fl-ambjent jistgħu jikkawżaw mortalità għolja u joħolqu riskju potenzjali għal P. gracilis. Għandha tiġi mħeġġa r-riċerka dwar l-ispeċi tal-anfibji, peress li d-dejta dwar dawn l-organiżmi hija skarsa, partikolarment dwar l-ispeċi Brażiljani.
It-test tat-tossiċità kronika dam 168 siegħa (7 ijiem) taħt kundizzjonijiet statiċi u l-konċentrazzjonijiet subletali kienu: 1, 3, 6 u 20 μg ai L−1. Fiż-żewġ esperimenti, 10 girwiel għal kull grupp ta’ trattament ġew evalwati b’sitt repliki, għal total ta’ 60 girwiel għal kull konċentrazzjoni. Sadanittant, it-trattament bl-ilma biss serva bħala kontroll negattiv. Kull setup sperimentali kien jikkonsisti minn dixx tal-ħġieġ sterili b’kapaċità ta’ 500 ml u densità ta’ girwiel wieħed għal kull 50 ml ta’ soluzzjoni. Il-flixkun kien mgħotti b’film tal-polietilene biex jipprevjeni l-evaporazzjoni u kien kontinwament arjat.
L-ilma ġie analizzat kimikament biex jiġu ddeterminati l-konċentrazzjonijiet tal-pestiċidi f'0, 96, u 168 siegħa. Skont Sabin et al. 68 u Martins et al. 69, l-analiżijiet twettqu fil-Laboratorju tal-Analiżi tal-Pestiċidi (LARP) tal-Università Federali ta' Santa Maria bl-użu ta' kromatografija tal-gass akkoppjata ma' spettrometrija tal-massa bi tliet kwadrupoli (Varian model 1200, Palo Alto, California, USA). Id-determinazzjoni kwantitattiva tal-pestiċidi fl-ilma hija murija bħala materjal supplimentari (Tabella SM1).
Għat-test tal-mikronukleu (MNT) u t-test tal-anormalità nukleari taċ-ċelluli ħomor (RNA), ġew analizzati 15-il girwien minn kull grupp ta' trattament. Il-girwien ġew anestetizzati b'5% lidocaine (50 mg g-170) u l-kampjuni tad-demm inġabru permezz ta' titqiba kardijaka bl-użu ta' siringi eparinizzati li jintremew. Tisjir tad-demm tħejjew fuq slajds sterili tal-mikroskopju, imnixxfa bl-arja, iffissati b'100% metanol (4 °C) għal 2 minuti, u mbagħad imtebbgħin b'soluzzjoni ta' 10% Giemsa għal 15-il minuta fid-dlam. Fi tmiem il-proċess, is-slajds inħaslu b'ilma distillat biex jitneħħa t-tebgħa żejda u mnixxfa f'temperatura tal-kamra.
Mill-inqas 1000 RBC minn kull girwien ġew analizzati bl-użu ta' mikroskopju ta' 100× b'objettiv ta' 71 biex tiġi ddeterminata l-preżenza ta' MN u ENA. Total ta' 75,796 RBC minn girwien ġew evalwati meta wieħed ikkunsidra l-konċentrazzjonijiet u l-kontrolli tas-cypermethrin. Il-ġenotossiċità ġiet analizzata skont il-metodu ta' Carrasco et al. u Fenech et al.38,72 billi ġiet iddeterminata l-frekwenza tal-leżjonijiet nukleari li ġejjin: (1) ċelluli anukleati: ċelluli mingħajr nuklei; (2) ċelluli apoptotiċi: frammentazzjoni nukleari, mewt ipprogrammata taċ-ċelluli; (3) ċelluli binukleati: ċelluli b'żewġ nuklei; (4) blanzuni nukleari jew ċelluli tal-bleb: ċelluli b'nuklei bi sporġenzi żgħar tal-membrana nukleari, blebs simili fid-daqs għall-mikronuklei; (5) ċelluli karjolizzati: ċelluli bil-kontorn tan-nukleu biss mingħajr materjal intern; (6) ċelloli mdaqqsa: ċelloli b'nuklei bi xquq jew daqqiet ovvji fil-forma tagħhom, imsejħa wkoll nuklei f'forma ta' kilwa; (7) ċelloli lobulati: ċelloli bi sporġenzi nukleari akbar mill-vesikoli msemmija hawn fuq; u (8) mikroċelloli: ċelloli b'nuklei kkondensati u ċitoplasma mnaqqsa. Il-bidliet tqabblu mar-riżultati tal-kontroll negattiv.
Ir-riżultati tat-test tat-tossiċità akuta (LC50) ġew analizzati bl-użu tas-softwer GBasic u l-metodu TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Id-dejta tat-test kroniku ġiet ittestjata minn qabel għan-normalità tal-iżball (Shapiro-Wilks) u l-omoġeneità tal-varjanza (Bartlett). Ir-riżultati ġew analizzati bl-użu tal-analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA). It-test ta' Tukey intuża biex iqabbel id-dejta bejniethom, u t-test ta' Dunnett intuża biex iqabbel id-dejta bejn il-grupp ta' trattament u l-grupp ta' kontroll negattiv.
Id-dejta tal-LOEC u l-NOEC ġiet analizzata bl-użu tat-test ta' Dunnett. It-testijiet statistiċi twettqu bl-użu tas-softwer Statistica 8.0 (StatSoft) b'livell ta' sinifikat ta' 95% (p < 0.05).
Ħin tal-posta: 13 ta' Marzu 2025