In-nematodu tal-arżnu huwa endoparassita migratorju ta' kwarantina magħruf li jikkawża telf ekonomiku sever fl-ekosistemi tal-foresti tal-arżnu. L-istudju preżenti jirrevedi l-attività nematiċida tal-indoli aloġenati kontra n-nematodi tal-arżnu u l-mekkaniżmu ta' azzjoni tagħhom. L-attivitajiet nematiċidi ta' 5-iodoindole u avermectin (kontroll pożittiv) kontra n-nematodi tal-arżnu kienu simili u għoljin f'konċentrazzjonijiet baxxi (10 μg/mL). 5-iodoindole naqqas il-fekundità, l-attività riproduttiva, il-mortalità embrijonika u larvali, u l-imġiba lokomotorja. L-interazzjonijiet molekulari tal-ligandi ma' riċetturi tal-kanal tal-klorur gated mill-glutamate speċifiċi għall-invertebrati jappoġġjaw l-idea li 5-iodoindole, bħall-avermectin, jintrabat sew mas-sit attiv tar-riċettur. 5-iodoindole wassal ukoll għal diversi deformazzjonijiet fenotipiċi fin-nematodi, inkluż kollass/tnaqqis anormali tal-organi u żieda fil-vakwolizzazzjoni. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-vakwoli jistgħu jkollhom rwol fil-mewt medjata mill-metilazzjoni tan-nematodi. Importanti, 5-iodoindole ma kienx tossiku għaż-żewġ speċi ta' pjanti (kaboċċa u ravanell). Għalhekk, dan l-istudju juri li l-applikazzjoni ta' iodoindole taħt kundizzjonijiet ambjentali tista' tikkontrolla l-ħsara kkawżata mid-dbiel tal-arżnu.
In-nematodu tal-injam tal-arżnu (Bursaphelenchus xylophilus) jappartjeni għan-nematodi tal-injam tal-arżnu (PWN), nematodi endoparassitiċi migratorji magħrufa li jikkawżaw ħsara ekoloġika severa lill-ekosistemi tal-foresti tal-arżnu1. Il-marda tad-dbiel tal-arżnu (PWD) ikkawżata min-nematodu tal-injam tal-arżnu qed issir problema serja f'diversi kontinenti, inklużi l-Asja u l-Ewropa, u fl-Amerika ta' Fuq, in-nematodu jeqred l-ispeċi tal-arżnu introdotti1,2. It-tnaqqis tas-siġar tal-arżnu huwa problema ekonomika ewlenija, u l-prospett tat-tixrid globali tiegħu huwa inkwetanti3. L-ispeċi tal-arżnu li ġejjin huma l-aktar attakkati min-nematodu: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, u Pinus radiata4. In-nematodu tal-arżnu huwa marda serja li tista' toqtol is-siġar tal-arżnu fi żmien ġimgħat jew xhur mill-infezzjoni. Barra minn hekk, it-tifqigħat tan-nematodi tal-arżnu huma komuni f'varjetà ta' ekosistemi, għalhekk ġew stabbiliti ktajjen ta' infezzjoni persistenti1.
Bursaphelenchus xylophilus huwa nematodu parassitiku tal-pjanti ta' kwarantina li jappartjeni għas-superfamilja Aphelenchoidea u l-klad 102.5. In-nematodu jiekol fungi u jirriproduċi fit-tessuti tal-injam tas-siġar tal-arżnu, u jiżviluppa f'erba' stadji larvali differenti: L1, L2, L3, L4 u individwu adult1,6. Taħt kundizzjonijiet ta' nuqqas ta' ikel, in-nematodu tal-arżnu jgħaddi fi stadju larvali speċjalizzat – dauer, li jipparassita l-vettur tiegħu – il-ħanfusa tal-qoxra tal-arżnu (Monochamus alternatus) u jiġi trasferit għal siġar tal-arżnu b'saħħithom. F'ospiti b'saħħithom, in-nematodi jemigraw malajr mit-tessuti tal-pjanti u jieklu ċelloli parenkimatużi, li jwassal għal numru ta' reazzjonijiet ta' sensittività eċċessiva, dbiel tal-arżnu u mewt fi żmien sena wara l-infezzjoni1,7,8.
Il-kontroll bijoloġiku tan-nematodi tal-arżnu ilu sfida, b'miżuri ta' kwarantina li jmorru lura għas-seklu 20. L-istrateġiji attwali għall-kontroll tan-nematodi tal-arżnu jinvolvu primarjament trattamenti kimiċi, inkluż fumigazzjoni tal-injam u impjantazzjoni ta' nematiċidi fi zkuk tas-siġar. L-aktar nematiċidi użati komunement huma avermectin u avermectin benzoate, li jappartjenu għall-familja avermectin. Dawn il-kimiċi għaljin huma effettivi ħafna kontra ħafna speċi ta' nematodi u huma kkunsidrati sikuri għall-ambjent9. Madankollu, l-użu ripetut ta' dawn in-nematiċidi huwa mistenni li joħloq pressjoni ta' selezzjoni li kważi ċertament twassal għall-emerġenza ta' nematodi tal-arżnu reżistenti, kif intwera għal diversi pesti tal-insetti, bħal Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella u n-nematodi Trichostrongylus colubriformis u Ostertagia circumcincta, li żviluppaw gradwalment reżistenza għall-avermectins10,11,12. Għalhekk, ix-xejriet ta' reżistenza jeħtieġ li jiġu studjati regolarment u n-nematiċidi skrinjati kontinwament biex jinstabu miżuri alternattivi, kosteffettivi u li ma jagħmlux ħsara lill-ambjent biex jikkontrollaw il-PVD. Fl-aħħar deċennji, għadd ta’ awturi pproponew l-użu ta’ estratti tal-pjanti, żjut essenzjali u sustanzi volatili bħala aġenti għall-kontroll tan-nematodi13,14,15,16.
Dan l-aħħar wrejna l-attività nematiċida tal-indole, molekula ta' sinjalar interċellulari u interrenji, f'Caenorhabditis elegans 17. L-indole huwa sinjal intraċellulari mifrux fl-ekoloġija mikrobjali, li jikkontrolla bosta funzjonijiet li jaffettwaw il-fiżjoloġija mikrobjali, il-formazzjoni tal-ispori, l-istabbiltà tal-plażmidi, ir-reżistenza għall-mediċini, il-formazzjoni tal-bijofilm, u l-virulenza 18, 19. L-attività tal-indole u d-derivattivi tiegħu kontra nematodi patoġeniċi oħra ma ġietx studjata. F'dan l-istudju, investigajna l-attività nematiċida ta' 34 indole kontra nematodi tal-arżnu u spjegajna l-mekkaniżmu ta' azzjoni tal-aktar 5-iodoindole qawwi bl-użu tal-mikroskopija, fotografija time-lapse, u esperimenti ta' docking molekulari, u vvalutajna l-effetti tossiċi tiegħu fuq il-pjanti bl-użu ta' assay tal-ġerminazzjoni taż-żerriegħa.
Konċentrazzjonijiet għoljin (>1.0 mM) ta' indole ġew irrappurtati qabel li għandhom effett nematiċida fuq in-nematodi17. Wara t-trattament ta' B. xylophilus (stadji tal-ħajja mħallta) bl-indole jew 33 derivattiv differenti tal-indole f'1 mM, il-mortalità ta' B. xylophilus ġiet imkejla billi ngħaddu n-nematodi ħajjin u mejtin fil-gruppi ta' kontroll u ttrattati. Ħames indoli wrew attività nematiċida sinifikanti; is-sopravivenza tal-grupp ta' kontroll mhux trattat kienet ta' 95 ± 7% wara 24 siegħa. Mit-34 indole ttestjati, 5-iodoindole u 4-fluoroindole f'1 mM ikkawżaw mortalità ta' 100%, filwaqt li 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate, u 7-iodoindole ikkawżaw mortalità ta' madwar 50% (Tabella 1).
Effett ta' 5-iodoindole fuq il-formazzjoni ta' vakwoli u l-metaboliżmu tan-nematodu tal-injam tal-arżnu. (A) Effett ta' avermectin u 5-iodoindole fuq nematodi maskili adulti, (B) bajd tan-nematodi fl-istadju L1 u (C) metaboliżmu ta' B. xylophilus, (i) vakwoli ma ġewx osservati f'0 siegħa, it-trattament irriżulta f'(ii) vakwoli, (iii) akkumulazzjoni ta' vakwoli multipli, (iv) nefħa tal-vakwoli, (v) fużjoni tal-vakwoli u (vi) formazzjoni ta' vakwoli ġganti. Vleġeġ ħomor jindikaw nefħa tal-vakwoli, vleġeġ blu jindikaw fużjoni tal-vakwoli u vleġeġ suwed jindikaw vakwoli ġganti. Skala tal-iskala = 50 μm.
Barra minn hekk, dan l-istudju ddeskriva wkoll il-proċess sekwenzjali tal-mewt indotta mill-metanu fin-nematodi tal-arżnu (Figura 4C). Il-mewt metanoġenika hija tip mhux apoptotiku ta’ mewt taċ-ċelluli assoċjata mal-akkumulazzjoni ta’ vakwoli ċitoplasmiċi prominenti27. Id-difetti morfoloġiċi osservati fin-nematodi tal-arżnu jidhru li huma relatati mill-qrib mal-mekkaniżmu tal-mewt indotta mill-metanu. Eżami mikroskopiku f’ħinijiet differenti wera li vakwoli ġganti ffurmaw wara 20 siegħa ta’ espożizzjoni għal 5-iodoindole (0.1 mM). Vakwoli mikroskopiċi ġew osservati wara 8 sigħat ta’ trattament, u n-numru tagħhom żdied wara 12-il siegħa. Diversi vakwoli kbar ġew osservati wara 14-il siegħa. Diversi vakwoli magħquda kienu viżibbli b’mod ċar wara 12–16-il siegħa ta’ trattament, li jindika li l-fużjoni tal-vakwoli hija l-bażi tal-mekkaniżmu tal-mewt metanoġenika. Wara 20 siegħa, instabu diversi vakwoli ġganti mad-dudu kollu. Dawn l-osservazzjonijiet jirrappreżentaw l-ewwel rapport ta’ metuożi f’C. elegans.
Fid-dud ittrattati b'5-iodoindole, ġew osservati wkoll aggregazzjoni u ksur tal-vakuoli (Fig. 5), kif evidenzjat mit-tgħawwiġ tad-dud u r-rilaxx tal-vakuoli fl-ambjent. It-tfixkil tal-vakuoli ġie osservat ukoll fil-membrana tal-qoxra tal-bajda, li normalment tiġi ppreservata intatta minn L2 waqt it-tfaqqis (Fig. Supplimentari S2). Dawn l-osservazzjonijiet jappoġġjaw l-involviment tal-akkumulazzjoni ta' fluwidu u falliment osmoregolatorju, kif ukoll ħsara riversibbli taċ-ċelluli (RCI), fil-proċess tal-formazzjoni u s-suppurazzjoni tal-vakuoli (Fig. 5).
Billi ipoteżizzajna r-rwol tal-jodju fil-formazzjoni tal-vakwoli osservata, investigajna l-attività nematiċida tal-jodur tas-sodju (NaI) u l-jodur tal-potassju (KI). Madankollu, f'konċentrazzjonijiet (0.1, 0.5 jew 1 mM), ma affettwawx la s-sopravivenza tan-nematodi u lanqas il-formazzjoni tal-vakwoli (Fig. Supplimentari S5), għalkemm 1 mM KI kellu effett nematiċida żgħir. Min-naħa l-oħra, 7-jodoindole (1 jew 2 mM), bħal 5-jodoindole, ikkaġuna vakwoli multipli u deformazzjonijiet strutturali (Fig. Supplimentari S6). Iż-żewġ jodoindoli wrew karatteristiċi fenotipiċi simili fin-nematodi tal-arżnu, filwaqt li NaI u KI ma għamlux dan. Interessanti, l-indole ma kkawżax formazzjoni ta' vakwoli f'B. xylophilus fil-konċentrazzjonijiet ittestjati (dejta mhux murija). Għalhekk, ir-riżultati kkonfermaw li l-kumpless indole-jodju huwa responsabbli għall-vakwolizzazzjoni u l-metaboliżmu ta' B. xylophilus.
Fost l-indoli ttestjati għall-attività nematiċida, 5-iodoindole kellu l-ogħla indiċi ta' slip ta' -5.89 kcal/mol, segwit minn 7-iodoindole (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindole (-4.33), u indole (-4.03) (Figura 6). Ir-rabta qawwija tal-idroġenu tal-ispina dorsali ta' 5-iodoindole ma' leucine 218 tistabbilizza r-rabta tiegħu, filwaqt li d-derivattivi l-oħra kollha tal-indole jorbtu mas-serine 260 permezz ta' bonds tal-idroġenu tal-katina tal-ġenb. Fost jodoindoli oħra mmudellati, 2-iodoindole għandu valur ta' rbit ta' -5.248 kcal/mol, li huwa dovut għall-bond ewlieni tal-idroġenu tiegħu mal-leucine 218. Irbit ieħor magħruf jinkludi 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4.0 kcal/mol), u 6-fluoroindole (-2.6 kcal/mol) (Figura Supplimentari S8). Il-biċċa l-kbira tal-indoli aloġenati u l-indol innifsu, bl-eċċezzjoni ta' 5-iodoindole u 2-iodoindole, jiffurmaw rabta mas-serina 260. Il-fatt li r-rabta tal-idroġenu mal-lewċina 218 hija indikattiva ta' rbit effiċjenti bejn ir-riċettur u l-ligand, kif osservat għall-ivermektina (Figura Supplimentari S7), jikkonferma li 5-iodoindole u 2-iodoindole, bħall-ivermektina, jorbtu sew mas-sit attiv tar-riċettur GluCL permezz tal-lewċina 218 (Figura 6 u Figura Supplimentari S8). Nipproponu li din ir-rabta hija meħtieġa biex tinżamm l-istruttura tal-pori miftuħa tal-kumpless GluCL u li billi jorbtu sew mas-sit attiv tar-riċettur GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermektina u ivermektina b'hekk iżommu l-kanal tal-jone miftuħ u jippermettu l-assorbiment tal-fluwidu.
Twaħħil molekulari ta' indole u indole aloġenat ma' GluCL. Orjentazzjonijiet ta' rbit ta' (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, u (D) ligandi 5-iodoindole mas-sit attiv ta' GluCL. Il-proteina hija rappreżentata minn żigarella, u l-bonds tal-idroġenu tas-sinsla huma murija bħala linji sofor bit-tikek. (A′), (B′), (C′), u (D′) juru l-interazzjonijiet tal-ligandi korrispondenti mar-residwi tal-amino acidi tal-madwar, u l-bonds tal-idroġenu tal-katina tal-ġenb huma indikati minn vleġeġ bit-tikek roża.
Saru esperimenti biex jiġi evalwat l-effett tossiku ta' 5-iodoindole fuq il-ġerminazzjoni taż-żerriegħa tal-kaboċċi u r-ravanell. 5-iodoindole (0.05 jew 0.1 mM) jew avermectin (10 μg/mL) kellhom ftit jew xejn effett fuq il-ġerminazzjoni inizjali u t-tfaċċar tal-pjanti żgħar (Figura 7). Barra minn hekk, ma nstabet l-ebda differenza sinifikanti bejn ir-rata ta' ġerminazzjoni ta' kontrolli mhux ittrattati u żrieragħ ittrattati b'5-iodoindole jew avermectin. L-effett fuq it-titwil tal-għeruq ewlenin u n-numru ta' għeruq laterali ffurmati kien insinifikanti, għalkemm 1 mM (10 darbiet il-konċentrazzjoni attiva tiegħu) ta' 5-iodoindole dewwem xi ftit l-iżvilupp tal-għeruq laterali. Dawn ir-riżultati jindikaw li 5-iodoindole mhuwiex tossiku għaċ-ċelloli tal-pjanti u ma jinterferixxix mal-proċessi tal-iżvilupp tal-pjanti fil-konċentrazzjonijiet studjati.
Effett ta' 5-iodoindole fuq il-ġerminazzjoni taż-żerriegħa. Ġerminazzjoni, nebbieta u għeruq laterali taż-żerriegħa ta' B. oleracea u R. raphanistrum fuq mezz ta' agar Murashige u Skoog b'avermectin jew 5-iodoindole jew mingħajru. Il-ġerminazzjoni ġiet irreġistrata wara 3 ijiem ta' inkubazzjoni f'22°C.
Dan l-istudju jirrapporta diversi każijiet ta’ qtil ta’ nematodi mill-indoli. Importanti, dan huwa l-ewwel rapport ta’ metilazzjoni li tinduċi l-jodoindole (proċess ikkawżat mill-akkumulazzjoni ta’ vakwoli żgħar li gradwalment jingħaqdu f’vakwoli ġganti, li eventwalment iwasslu għal ksur tal-membrana u mewt) fil-labar tal-arżnu, bil-jodoindole juri proprjetajiet nematiċidali sinifikanti simili għal dawk tan-nematiċida kummerċjali avermectin.
L-indoli ġew irrappurtati qabel li jeżerċitaw diversi funzjonijiet ta' sinjalazzjoni fil-prokarioti u l-ewkarjoti, inkluż l-inibizzjoni/formazzjoni tal-bijofilm, is-sopravivenza batterika, u l-patoġeniċità19,32,33,34. Riċentement, l-effetti terapewtiċi potenzjali tal-indoli aloġenati, l-alkalojdi tal-indol, u d-derivattivi semisintetiċi tal-indol ġibdu interess estensiv fir-riċerka35,36,37. Pereżempju, intwera li l-indoli aloġenati joqtlu ċ-ċelloli persistenti ta' Escherichia coli u Staphylococcus aureus37. Barra minn hekk, huwa ta' interess xjentifiku li tiġi studjata l-effikaċja tal-indoli aloġenati kontra speċi, ġeneri u renji oħra, u dan l-istudju huwa pass lejn il-kisba ta' dan il-għan.
Hawnhekk, nipproponu mekkaniżmu għal letalità indotta minn 5-iodoindole f'C. elegans ibbażat fuq ħsara riversibbli taċ-ċelluli (RCI) u metilazzjoni (Figuri 4C u 5). Bidliet edematożi bħal nefħa u deġenerazzjoni vakuolari huma indikaturi ta' RCI u metilazzjoni, manifestati bħala vakuoli ġganti fiċ-ċitoplasma48,49. RCI jinterferixxi mal-produzzjoni tal-enerġija billi jnaqqas il-produzzjoni tal-ATP, u jikkawża ħsara fil-pompa ATPase, jew ifixkel il-membrani taċ-ċelluli u jikkawża influss rapidu ta' Na+, Ca2+, u ilma50,51,52. Vakuoli intraċitoplasmiċi jinqalgħu fiċ-ċelluli tal-annimali bħala riżultat tal-akkumulazzjoni ta' fluwidu fiċ-ċitoplasma minħabba l-influss ta' Ca2+ u ilma53. Interessanti, dan il-mekkaniżmu ta’ ħsara fiċ-ċelluli huwa riversibbli jekk il-ħsara tkun temporanja u ċ-ċelluli jibdew jipproduċu ATP għal ċertu perjodu ta’ żmien, imma jekk il-ħsara tippersisti jew tiggrava, iċ-ċelluli jmutu.54 L-osservazzjonijiet tagħna juru li n-nematodi ttrattati b’5-iodoindole ma jistgħux jirrestawraw il-bijosintesi normali wara espożizzjoni għal kundizzjonijiet ta’ stress.
Il-fenotip tal-metilazzjoni indott minn 5-iodoindole f'B. xylophilus jista' jkun dovut għall-preżenza tal-jodju u d-distribuzzjoni molekulari tiegħu, peress li 7-iodoindole kellu inqas effett inibitorju fuq B. xylophilus milli 5-iodoindole (Tabella 1 u Figura Supplimentari S6). Dawn ir-riżultati huma parzjalment konsistenti mal-istudji ta' Maltese et al. (2014), li rrappurtaw li t-traslokazzjoni tal-parti tan-nitroġenu piridil fl-indole mill-pożizzjoni para- għall-pożizzjoni meta abolixxiet il-vakwolizzazzjoni, l-inibizzjoni tat-tkabbir, u ċ-ċitotossiċità fiċ-ċelloli U251, li jissuġġerixxi li l-interazzjoni tal-molekula ma' sit attiv speċifiku fil-proteina hija kritika27,44,45. L-interazzjonijiet bejn l-indole jew l-indoli aloġenati u r-riċetturi GluCL osservati f'dan l-istudju jappoġġjaw ukoll din l-idea, peress li 5- u 2-iodoindole nstab li jorbtu mar-riċetturi GluCL b'mod aktar qawwi mill-indoli l-oħra eżaminati (Figura 6 u Figura Supplimentari S8). L-jodju fit-tieni jew il-ħames pożizzjoni tal-indole nstab li jorbot mal-lewċina 218 tar-riċettur GluCL permezz ta' bonds tal-idroġenu tal-ispina dorsali, filwaqt li indoli aloġenati oħra u l-indole nnifsu jiffurmaw bonds tal-idroġenu dgħajfa tal-katina tal-ġenb mas-serina 260 (Figura 6). Għalhekk nispekulaw li l-lokalizzazzjoni tal-aloġenu għandha rwol importanti fl-induzzjoni tad-deġenerazzjoni vakuolari, filwaqt li r-rabta qawwija ta' 5-iodoindole żżomm il-kanal tal-jone miftuħ, u b'hekk tippermetti influss rapidu ta' fluwidu u ksur tal-vakuole. Madankollu, il-mekkaniżmu dettaljat ta' azzjoni ta' 5-iodoindole għad irid jiġi determinat.
Qabel l-applikazzjoni prattika ta' 5-iodoindole, għandu jiġi analizzat l-effett tossiku tiegħu fuq il-pjanti. L-esperimenti tagħna dwar il-ġerminazzjoni taż-żerriegħa wrew li 5-iodoindole ma kellu l-ebda effett negattiv fuq il-ġerminazzjoni taż-żerriegħa jew proċessi ta' żvilupp sussegwenti fil-konċentrazzjonijiet studjati (Figura 7). Għalhekk, dan l-istudju jipprovdi bażi għall-użu ta' 5-iodoindole fl-ambjent ekoloġiku biex jikkontrolla l-ħsara tan-nematodi tal-arżnu għas-siġar tal-arżnu.
Rapporti preċedenti wrew li t-terapija bbażata fuq l-indole tirrappreżenta approċċ potenzjali biex tindirizza l-problema tar-reżistenza għall-antibijotiċi u l-progressjoni tal-kanċer55. Barra minn hekk, l-indoli għandhom attivitajiet antibatteriċi, kontra l-kanċer, antiossidanti, anti-infjammatorji, antidijabetiċi, antivirali, antiproliferattivi u kontra t-tuberkulożi u jistgħu jservu bħala bażi promettenti għall-iżvilupp ta’ mediċini56,57. Dan l-istudju jissuġġerixxi għall-ewwel darba l-użu potenzjali tal-jodju bħala aġent antiparassitiku u antelmintiku.
L-Avermectin ġie skopert tliet deċennji ilu u rebaħ il-Premju Nobel fl-2015, u l-użu tiegħu bħala antielmintiku għadu għaddej b'mod attiv. Madankollu, minħabba l-iżvilupp mgħaġġel tar-reżistenza għall-avermectins fin-nematodi u l-pesti tal-insetti, hija meħtieġa strateġija alternattiva, bi prezz baxx u li ma tagħmilx ħsara lill-ambjent biex tikkontrolla l-infezzjoni tal-PWN fis-siġar tal-arżnu. Dan l-istudju jirrapporta wkoll il-mekkaniżmu li bih il-5-iodoindole joqtol in-nematodi tal-arżnu u li l-5-iodoindole għandu tossiċità baxxa għaċ-ċelloli tal-pjanti, li jiftaħ prospetti tajbin għall-applikazzjoni kummerċjali futura tiegħu.
L-esperimenti kollha ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Università ta' Yeungnam, Gyeongsan, il-Korea, u l-metodi twettqu skont il-linji gwida tal-Kumitat tal-Etika tal-Università ta' Yeungnam.
Esperimenti ta' inkubazzjoni tal-bajd twettqu bl-użu ta' proċeduri stabbiliti43. Biex jiġu vvalutati r-rati tat-tfaqqis (HR), nematodi adulti ta' ġurnata (madwar 100 mara u 100 raġel) ġew trasferiti għal platti Petri li fihom il-fungus u tħallew jikbru għal 24 siegħa. Il-bajd imbagħad ġie iżolat u ttrattat b'5-iodoindole (0.05 mM u 0.1 mM) jew avermectin (10 μg/ml) bħala sospensjoni f'ilma distillat sterili. Dawn is-sospensjonijiet (500 μl; madwar 100 bajda) ġew trasferiti għall-bjar ta' pjanċa ta' kultura ta' tessuti b'24 bjar u inkubati f'22 °C. L-għadd ta' L2 sar wara 24 siegħa ta' inkubazzjoni iżda tqies mejta jekk iċ-ċelloli ma mxewx meta ġew stimulati b'wajer fin tal-platinu. Dan l-esperiment twettaq f'żewġ stadji, kull wieħed b'sitt ripetizzjonijiet. Id-dejta miż-żewġ esperimenti ġiet ikkombinata u ppreżentata. Il-perċentwal ta' HR huwa kkalkulat kif ġej:
Il-mortalità tal-larva ġiet ivvalutata bl-użu ta' proċeduri żviluppati qabel. Il-bajd tan-nematodi nġabar u l-embrijuni ġew sinkronizzati billi tfaqqsu f'ilma distillat sterili biex jiġġeneraw larva fl-istadju L2. Larva sinkronizzata (madwar 500 nematodu) ġiet ittrattata b'5-iodoindole (0.05 mM u 0.1 mM) jew avermectin (10 μg/ml) u trabbew fuq pjanċi Petri ta' B. cinerea. Wara 48 siegħa ta' inkubazzjoni f'22 °C, in-nematodi nġabru f'ilma distillat sterili u ġew eżaminati għall-preżenza tal-istadji L2, L3, u L4. Il-preżenza tal-istadji L3 u L4 indikat trasformazzjoni larvali, filwaqt li l-preżenza tal-istadju L2 ma indikat l-ebda trasformazzjoni. L-immaġini nkisbu bl-użu tas-Sistema Diġitali tal-Immaġini taċ-Ċelloli iRiS™. Dan l-esperiment twettaq f'żewġ stadji, kull wieħed b'sitt ripetizzjonijiet. Id-dejta miż-żewġ esperimenti ġiet ikkombinata u ppreżentata.
It-tossiċità ta' 5-iodoindole u avermectin għaż-żerriegħa ġiet ivvalutata bl-użu ta' testijiet tal-ġerminazzjoni fuq pjanċi tal-agar Murashige u Skoog. 62 żerriegħa ta' B. oleracea u R. raphanistrum l-ewwel ġew mgħaddsa f'ilma distillat sterili għal ġurnata waħda, maħsula b'1 ml 100% etanol, sterilizzati b'1 ml 50% bliċ kummerċjali (3% sodium hypochlorite) għal 15-il minuta, u maħsula ħames darbiet b'1 ml ilma sterili. Iż-żerriegħa sterilizzata mbagħad ġiet ippressata fuq pjanċi tal-agar tal-ġerminazzjoni li fihom 0.86 g/l (0.2X) mezz Murashige u Skoog u 0.7% agar batterjoloġiku b'5-iodoindole jew avermectin jew mingħajru. Il-pjanċi mbagħad ġew inkubati f'22 °C, u l-immaġini ttieħdu wara 3 ijiem ta' inkubazzjoni. Dan l-esperiment twettaq f'żewġ stadji, li kull wieħed minnhom kellu sitt ripetizzjonijiet.
Ħin tal-posta: 26 ta' Frar 2025