Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għal riżultati aħjar, nirrakkomandaw li tuża verżjoni aktar ġdida tal-browser tiegħek (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, qed nuru s-sit mingħajr stil jew JavaScript.
L-iskoperta u l-użu benefiċjali ta' prodotti naturali jistgħu jgħinu biex titjieb il-ħajja tal-bniedem. Kimiċi inibitorji tat-tkabbir tal-pjanti jintużaw ħafna bħala erbiċidi biex jikkontrollaw il-ħaxix ħażin. Minħabba l-ħtieġa li jintużaw tipi differenti ta' erbiċidi, hemm bżonn li jiġu identifikati komposti b'mekkaniżmi ta' azzjoni ġodda. F'dan l-istudju, skoprejna kompost ġdid ta' N-alkoxypyrrole, coumamonamide, minn Streptomyces werraensis MK493-CF1 u stabbilixxejna l-proċess sħiħ tas-sintesi. Permezz ta' analiżi tal-attività bijoloġika, skoprejna li l-aċidu urs-monoamiku huwa intermedju sintetiku tal-urs-monoamide u potenzjal...inibitur tat-tkabbir tal-pjantiBarra minn hekk, żviluppajna diversi derivattivi tal-aċidu urbenoniku, inkluż id-derivattiv tal-urbenyloxy (UDA), li għandu attività erbiċida għolja mingħajr ma jaffettwa b'mod negattiv it-tkabbir taċ-ċelloli HeLa. Sibna wkoll li d-derivattivi tal-aċidu urmotoniku jfixklu l-mikrotubuli tal-pjanti; barra minn hekk, il-KAND jaffettwa l-filamenti tal-actina u jikkaġuna l-mewt taċ-ċelloli; Dawn l-effetti b'ħafna aspetti huma differenti minn dawk ta' inibituri tal-mikrotubuli magħrufa u jissuġġerixxu mekkaniżmu ġdid ta' azzjoni għall-aċidu ursoniku, li jirrappreżenta vantaġġ importanti fl-iżvilupp ta' erbiċidi ġodda.
L-iskoperta u l-applikazzjoni prattika ta’ prodotti naturali ta’ benefiċċju u d-derivattivi tagħhom huma mezz biex tittejjeb il-kwalità tal-ħajja tal-bniedem. Metaboliti sekondarji prodotti minn mikro-organiżmi, pjanti u insetti wasslu għal avvanzi kbar fil-mediċina u l-agrikoltura. Ħafna antibijotiċi u mediċini kontra l-lewkimja ġew żviluppati minn prodotti naturali. Barra minn hekk, diversi tipi ta’pestiċidi, il-funġiċidi u l-erbiċidi huma estratti minn dawn il-prodotti naturali għall-użu fl-agrikoltura. B'mod partikolari, l-erbiċidi għall-kontroll tal-ħaxix ħażin huma għodod importanti biex jiżdiedu r-rendiment tal-għelejjel fl-agrikoltura moderna, u diversi tipi ta' komposti diġà jintużaw kummerċjalment. Diversi proċessi ċellulari fil-pjanti, bħall-fotosintesi, il-metaboliżmu tal-aċidi amminiċi, is-sintesi tal-ħitan taċ-ċelluli, ir-regolazzjoni tal-mitożi, is-sinjalar tal-fitormoni, jew is-sintesi tal-proteini, huma kkunsidrati bħala miri tipiċi tal-erbiċidi. Il-komposti li jinibixxu l-funzjoni tal-mikrotubuli huma klassi komuni ta' erbiċidi li jaffettwaw it-tkabbir tal-pjanti billi jaffettwaw ir-regolazzjoni mitotika2.
Il-mikrotubuli huma komponenti taċ-ċitoskeletru u huma kkonservati b'mod wiesa' fiċ-ċelloli ewkarjotiċi. L-eterodimeru tat-tubulina jikkonsisti minn α-tubulina u β-tubulina li jiffurmaw protofilamenti lineari ta' mikrotubuli, bi 13-il protofilament li jiffurmaw struttura ċilindrika. Il-mikrotubuli għandhom rwoli multipli fiċ-ċelloli tal-pjanti, inkluż id-determinazzjoni tal-forma taċ-ċelloli, id-diviżjoni taċ-ċelloli, u t-trasport intraċellulari3,4. Iċ-ċelloli tal-pjanti fihom mikrotubuli taħt il-membrana tal-plażma interfażika, u dawn l-hekk imsejħa mikrotubuli kortikali huma maħsuba li jikkontrollaw l-organizzazzjoni tal-mikrofibrilli taċ-ċelluloża permezz tar-regolazzjoni tal-kumplessi tas-sintasi taċ-ċelluloża4,5. Il-mikrotubuli kortikali taċ-ċelloli epidermali tal-għeruq, preżenti fiż-żona ta' titwil rapidu tal-ponta tal-għerq, jinsabu lateralment, u l-mikrofibri taċ-ċelluloża jsegwu dawn il-mikrotubuli u jillimitaw id-direzzjoni tal-espansjoni taċ-ċelloli, u b'hekk jippromwovu t-titwil anisotropiku taċ-ċelloli. Għalhekk, il-funzjoni tal-mikrotubuli hija relatata mill-qrib mal-morfoloġija tal-pjanti. Sostituzzjonijiet tal-aċidi amminiċi f'ġeni li jikkodifikaw it-tubulina jikkawżaw żbilanċ tal-matriċi tal-mikrotubuli kortikali u tkabbir fuq in-naħa tax-xellug jew tal-lemin f'Arabidopsis 6,7. Bl-istess mod, mutazzjonijiet fi proteini assoċjati mal-mikrotubuli li jirregolaw id-dinamika tal-mikrotubuli jistgħu wkoll iwasslu għal tkabbir mgħawweġ tal-għeruq8,9,10,11,12,13. Barra minn hekk, it-trattament b'erbiċidi li jfixklu l-mikrotubuli bħal disopyramide, magħruf ukoll bħala pretilachlor, jikkawża wkoll tkabbir tal-għeruq oblikwi fuq in-naħa tax-xellug14. Din id-dejta tindika li regolazzjoni preċiża tal-funzjoni tal-mikrotubuli hija kritika biex tiddetermina d-direzzjoni tat-tkabbir tal-pjanti.
Ġew skoperti diversi tipi ta' inibituri tal-mikrotubuli, u dawn il-mediċini taw kontribuzzjonijiet sinifikanti għar-riċerka ċitoskeletali, kif ukoll għall-agrikoltura u l-mediċina2. B'mod partikolari, oryzalin, komposti tad-dinitroanilina, disopyramide, komposti relatati mal-benzamide, u l-analogi tagħhom jistgħu jinibixxu l-funzjoni tal-mikrotubuli u b'hekk jinibixxu t-tkabbir tal-pjanti. Għalhekk, jintużaw ħafna bħala erbiċidi. Madankollu, peress li l-mikrotubuli huma komponent importanti taċ-ċelloli tal-pjanti u tal-annimali, ħafna mill-inibituri tal-mikrotubuli huma ċitotossiċi għaż-żewġ tipi ta' ċelloli. Għalhekk, minkejja l-utilità rikonoxxuta tagħhom bħala erbiċidi, numru limitat ta' aġenti antimikrotubuli jintużaw għal skopijiet prattiċi.
Streptomyces huwa ġeneru tal-familja Streptomyces, li jinkludi batterji aerobiċi, gram-pożittivi, filamentożi u huwa magħruf sew għall-abbiltà tiegħu li jipproduċi firxa wiesgħa ta' metaboliti sekondarji. Għalhekk, huwa kkunsidrat bħala wieħed mill-aktar sorsi importanti ta' prodotti naturali bijoloġikament attivi ġodda. Fl-istudju attwali, skoprejna kompost ġdid imsejjaħ coumamonamide, li ġie iżolat minn Streptomyces werraensis MK493-CF1 u S. werraensis ISP 5486. Bl-użu ta' analiżi spettrali u analiżi spettrali sħiħa, l-istruttura tal-coumamonamide ġiet ikkaratterizzata u l-iskeletru uniku tagħha ta' N-alkoxypyrrole ġie determinat fis-sintesi. L-aċidu ursoniku, intermedju sintetiku tal-ursmonoamide u d-derivattivi tiegħu, instab li jinibixxi t-tkabbir u l-ġerminazzjoni tal-pjanta mudell popolari Arabidopsis thaliana. Fi studju dwar ir-relazzjoni bejn l-istruttura u l-attività, sibna li kompost b'C9 modifikat għal aċidu ursoniku, imsejjaħ nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), itejjeb b'mod sinifikanti l-effett inibitorju fuq it-tkabbir u l-ġerminazzjoni. Ta' min jinnota li l-inibitur tat-tkabbir tal-pjanti li għadu kif ġie skopert affettwa wkoll it-tkabbir tat-tabakk u l-liverwort u ma kienx ċitotossiku għall-batterji jew għaċ-ċelloli HeLa. Barra minn hekk, xi derivattivi tal-aċidu urmotoniku jinduċu fenotip tal-għeruq mgħawweġ, li jimplika li dawn id-derivattivi jaffettwaw direttament jew indirettament il-mikrotubuli. Konsistenti ma' din l-idea, l-osservazzjonijiet tagħna ta' mikrotubuli ttikkettati jew immunoistokimikament jew bi proteini fluworexxenti jindikaw li t-trattament KAND jiddepolimerizza l-mikrotubuli. Barra minn hekk, it-trattament b'derivattivi tal-aċidu kumamotoniku ħarbat il-mikrofilamenti tal-actina. Għalhekk, skoprejna inibitur ġdid tat-tkabbir tal-pjanti li l-mekkaniżmu uniku ta' azzjoni tiegħu jinvolvi l-qerda taċ-ċitoskeletru.
Ir-razza MK493-CF1 ġiet iżolata mill-ħamrija f'Shinagawa-ku, Tokyo. Ir-razza MK493-CF1 iffurmat miċelju stromali ramifikat sew. Is-sekwenza parzjali tal-ġene RNA ribosomali 16S (1422 bp) ġiet determinata. Din ir-razza hija simili ħafna għal S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: razza tipika, 99.93%). Abbażi ta' dan ir-riżultat, ġie determinat li din ir-razza kienet relatata mill-qrib mar-razza tat-tip ta' S. werraensis. Għalhekk, semmejna din ir-razza b'mod proviżorju S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T tipproduċi wkoll l-istess komposti bijoattivi. Peress li kien hemm ftit riċerka bikrija dwar il-kisba ta' prodotti naturali minn dan il-mikroorganiżmu, twettqet aktar riċerka kimika. Wara l-kultivazzjoni ta' S. werraensis MK493-CF1 fuq mezz tax-xgħir permezz ta' fermentazzjoni fi stat solidu f'temperatura ta' 30°C għal 14-il jum, il-mezz ġie estratt b'50% EtOH. 60 ml tal-kampjun ġew imnixxfa biex jinkisbu 59.5 mg ta' estratt mhux raffinat. L-estratt mhux raffinat ġie soġġett għal HPLC ta' fażi inversa biex jagħti N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, imsejjaħ coumamonamide, 36.0 mg). L-ammont totali ta' 1 huwa madwar 60% tal-estratt mhux raffinat. Għalhekk, iddeċidejna li nistudjaw fid-dettall il-proprjetajiet ta' kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 huwa trab amorfu abjad u l-ispettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (HRESIMS) tikkonferma C6H8N2O2 (Fig. 1). Il-framment tal-pirrol sostitwit bis-C2 ta' dan il-kompost huwa kkaratterizzat minn δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH fl-ispettru 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) u δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), u l-ispettru 13C NMR juri l-preżenza ta' erba' atomi tal-karbonju sp2. Il-preżenza ta' grupp amide fil-pożizzjoni C2 ġiet ivvalutata permezz ta' korrelazzjoni HMBC mill-proton C-3 għall-karbonju karboniliku tal-amide f'δC 161.1. Barra minn hekk, il-qċaċet 1 H u 13 C NMR f'δH 4.10 (3H, S) u δC 68.3 jindikaw il-preżenza ta' gruppi N-metossi fil-molekula. Għalkemm il-pożizzjoni korretta tal-grupp metossi kienet għadha ma ġietx determinata bl-użu ta' analiżi spettroskopika bħal spettroskopija ta' differenza msaħħa u abbrevjazzjoni nukleari Overhauser (NOEDF), N-metossi-1H-pirrol-2-karbossamide sar l-ewwel kompost kandidat.
Biex tiġi ddeterminata l-istruttura korretta ta' 1, twettqet sinteżi totali (Fig. 2a). It-trattament ta' 2-aminopyridine 2 disponibbli kummerċjalment b'm-CPBA rriżulta fl-N-oxide 3 korrispondenti f'rendiment kwantitattiv. Wara t-2-aminoazidazzjoni ta' 2, ir-reazzjoni ta' ċiklokondensazzjoni deskritta minn Abramovich twettqet fil-benżin f'90°C biex tinkiseb l-1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 mixtieq fi grammi. Veloċità 60% (żewġ stadji). 15,16. Il-metilazzjoni u l-idroliżi ta' 4 imbagħad taw l-aċidu 1-metossi-1H-pyrrole-2-karbossiliku (imsejjaħ "aċidu kumotoniku", 6) f'rendiment tajjeb (70%, żewġ stadji). Fl-aħħar, l-amidazzjoni permezz tal-intermedjarju tal-klorur tal-aċidu 6 bl-użu ta' ammonja milwiema tat Kumamoto amide 1 f'rendiment ta' 98%. Id-dejta spettrali kollha ta' 1 sintetizzat kienet simili għal 1 iżolat, għalhekk l-istruttura ta' 1 ġiet iddeterminata;
Sintesi ġenerali u analiżi tal-attività bijoloġika tal-urbenamide u l-aċidu urbeniku. (a) Sintesi totali tal-amide ta' Kumamoto. (b) Nebbieta ta' Arabidopsis Columbia (Col) tat-tip selvaġġ ta' sebat ijiem tkabbru fuq pjanċi Murashige u Skoog (MS) li fihom coumamonamide 6 jew coumamonamide 1 fil-konċentrazzjonijiet indikati. Skala tal-iskala = 1 ċm.
L-ewwel, ivvalutajna l-attivitajiet bijoloġiċi tal-urbenamide u l-intermedjati tiegħu għall-abbiltà tagħhom li jimmodulaw it-tkabbir tal-pjanti. Żidna diversi konċentrazzjonijiet ta' ursmonamide 1 jew aċidu ursoniku 6 ma' mezz MS agar u kkultivajna nebbieta ta' Arabidopsis thaliana fuq dan il-mezz. Dawn l-assaġġi wrew li konċentrazzjonijiet għoljin (500 μM) ta' 6 inibixxu t-tkabbir tal-għeruq (Fig. 2b). Imbagħad, ġġenerajna diversi derivattivi billi ssostitwixxejna l-pożizzjoni N1 ta' 6 u wettaqna studji dwar ir-relazzjoni bejn l-istruttura u l-attività fuqhom (il-proċess ta' sinteżi analoga huwa deskritt fl-Informazzjoni ta' Appoġġ (SI)). In-nebbieta ta' Arabidopsis tkabbru fuq mezz li fih 50 μM derivattivi tal-aċidu ursoniku, u tkejjel it-tul tal-għeruq, kif muri fl-istampa. Kif muri fil-Figuri 3a, b, u S1, l-aċidi coumamo għandhom tulijiet differenti ta' ktajjen alkossiċi lineari (9, 10, 11, 12, u 13) jew ktajjen alkossiċi kbar (15, 16, u 17) fil-pożizzjoni N1. Id-derivattivi wrew inibizzjoni sinifikanti tat-tkabbir tal-għeruq. Barra minn hekk, sibna li l-applikazzjoni ta' 200 μM 10, 11, jew 17 inibixxiet il-ġerminazzjoni (Figuri 3c u S2).
Studju tar-relazzjoni bejn l-istruttura u l-attività tal-amide ta' Kumamoto u komposti relatati. (a) Skema ta' struttura u sinteżi tal-analogi. (b) Kwantifikazzjoni tat-tul tal-għeruq ta' nebbieta ta' 7 ijiem imkabbra fuq mezz MS b'derivattivi ta' coumamonamide ta' 50 μM jew mingħajrhom. L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bit-trattament finta (test t, p< 0.05).n>18. Id-dejta hija murija bħala medja ± SD. nt tfisser “mhux ittestjat” għaliex aktar minn 50% taż-żerriegħa ma ġerminawx. (ċ) Kwantifikazzjoni tar-rata ta' ġerminazzjoni taż-żerriegħa ttrattata inkubata għal 7 ijiem f'mezz MS b'200 μM coumamonamide u komposti relatati jew mingħajrhom. L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bit-trattament finta (test chi-square). n=96.
Interessanti, iż-żieda ta' ktajjen tal-ġenb alkiliċi itwal minn C9 naqqset l-attività inibitorja, u dan jissuġġerixxi li l-komposti relatati mal-aċidu kumamotoiku jeħtieġu ktajjen tal-ġenb ta' ċertu daqs biex juru l-attività bijoloġika tagħhom.
Minħabba li l-analiżi tar-relazzjoni bejn l-istruttura u l-attività wriet li C9 ġie modifikat għal aċidu ursoniku u d-derivattiv nonilossidu tal-aċidu ursoniku (minn hawn 'il quddiem imsejjaħ KAND 11) kien l-aktar inibitur effettiv tat-tkabbir tal-pjanti, wettaqna karatterizzazzjoni aktar dettaljata ta' KAND 11. It-trattament ta' Arabidopsis b'50 μM KAND 11 kważi ppreveniet kompletament il-ġerminazzjoni, filwaqt li konċentrazzjonijiet aktar baxxi (40, 30, 20, jew 10 μM) ta' KAND 11 inibixxu t-tkabbir tal-għeruq b'mod dipendenti mid-doża (Fig. 4a, b). Biex nittestjaw jekk KAND 11 jaffettwax il-vijabbiltà tal-meristem tal-għeruq, eżaminajna l-meristem tal-għeruq imtebbgħin bil-jodur tal-propidju (PI) u kejjilna d-daqs taż-żona tal-meristem. Id-daqs tal-meristema tan-nebbieta mkabbra fuq mezz li fih 25 μM KAND-11 kien ta' 151.1 ± 32.5 μm, filwaqt li d-daqs tal-meristema tan-nebbieta mkabbra fuq mezz ta' kontroll li fih DMSO kien ta' 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d), li jindika li KAND-11 jirrestawra l-attività ċellulari. tixrid. Meristema tal-għerq. Konsistenti ma' dan, it-trattament KAND 11 naqqas l-ammont tas-sinjal tal-markatur tad-diviżjoni taċ-ċelluli CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS fil-meristema tal-għerq (Fig. 4e) 17. Dawn ir-riżultati jindikaw li KAND 11 jinibixxi t-tkabbir tal-għeruq billi jnaqqas l-attività tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli.
Analiżi tal-effett inibitorju tad-derivattivi tal-aċidu urbeniku (derivattivi urbenyloxy) fuq it-tkabbir. (a) Nebbieta tat-tip selvaġġ Col ta' 7 ijiem imkabbra fuq pjanċi MS bil-konċentrazzjonijiet indikati ta' KAND 11. Skala tal-iskala = 1 ċm. (b) Kwantifikazzjoni tat-tul tal-għerq. L-ittri jindikaw differenzi sinifikanti (test Tukey HSD, p< 0.05).n>16. Id-dejta hija murija bħala medja ± SD. (ċ) Mikroskopija konfokali ta' għeruq Col tat-tip selvaġġ imtebbgħin bil-jodur tal-propidju mkabbra fuq pjanċi MS b'25 μM KAND 11 jew mingħajru. Il-parentesi bojod jindikaw il-meristem tal-għerq. L-iskala tal-iskala = 100 µm. (d) Kwantifikazzjoni tad-daqs tal-meristem tal-għerq (n = 10 sa 11). Id-differenzi statistiċi ġew determinati bl-użu tat-test t (p< 0.05). Il-vireg jirrappreżentaw id-daqs medju tal-meristem. (e) Mikroskopija ta' kuntrast ta' interferenza differenzjali (DIC) ta' meristema ta' għerq li fiha l-kostruzzjoni CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS imtebba' u mtebba' fuq nebbieta ta' 5 ijiem imkabbra fuq pjanċi MS b'assaġġ KAND ta' 25 µM jew mingħajru.
Il-fitotossiċità ta' KAND 11 ġiet ittestjata aktar bl-użu ta' pjanta dikotiledoni oħra, it-tabakk (Nicotiana tabacum), u organiżmu mudell ewlieni ta' pjanta tal-art, il-liverwort (Marchantia polymorpha). Bħal fil-każ ta' Arabidopsis, in-nebbieta tat-tabakk SR-1 imkabbra fuq mezz li fih 25 μM KAND 11 ipproduċew għeruq iqsar (Fig. 5a). Barra minn hekk, 40 minn 48 żerriegħa ġerminaw fuq pjanċi li fihom 200 μM KAND 11, filwaqt li t-48 żerriegħa kollha ġerminaw fuq mezz ittrattat b'mod finta, li jindika li konċentrazzjonijiet ogħla ta' KAND kienu sinifikanti (p< 0.05; test chi -kwadru) inibixxa l-ġerminazzjoni tat-tabakk. (Fig. 5b). Barra minn hekk, il-konċentrazzjoni ta' KAND 11 li inibixxiet it-tkabbir batterjali fil-liverwort kienet simili għall-konċentrazzjoni effettiva f'Arabidopsis (Fig. 5c). Dawn ir-riżultati jindikaw li KAND 11 jista' jinibixxi t-tkabbir ta' varjetà ta' pjanti. Imbagħad investigajna ċ-ċitotossiċità possibbli ta' komposti relatati mal-monoamide tal-ors f'organiżmi oħra, jiġifieri ċelloli HeLa umani u r-razza Escherichia coli DH5α, bħala rappreżentanti ta' ċelloli tal-annimali u batteriċi ogħla, rispettivament. F'serje ta' assays ta' proliferazzjoni taċ-ċelloli, osservajna li coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, u KAND 11 ma affettwawx it-tkabbir taċ-ċelloli HeLa jew E. coli f'konċentrazzjonijiet ta' 100 μM (Fig. 5d,e).
Inibizzjoni tat-tkabbir ta' KAND 11 f'organiżmi mhux Arabidopsis. (a) Nebbieta tat-tabakk SR-1 tat-tip selvaġġ ta' ġimagħtejn tkabbru fuq pjanċi MS pożizzjonati vertikalment li fihom 25 μM KAND 11. (b) Nebbieta tat-tabakk SR-1 tat-tip selvaġġ ta' ġimagħtejn tkabbru fuq pjanċi MS pożizzjonati orizzontalment li fihom 200 μM KAND 11. (ċ) Blanzuni tal-liverwort Tak-1 tat-tip selvaġġ ta' ġimagħtejn imkabbra fuq pjanċi Gamborg B5 bil-konċentrazzjonijiet indikati ta' KAND 11. Il-vleġeġ ħomor jindikaw spori li waqfu jikbru fil-perjodu ta' inkubazzjoni ta' ġimagħtejn. (d) Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli taċ-ċelloli HeLa. In-numru ta' ċelloli vijabbli tkejjel f'intervalli ta' żmien fissi bl-użu ta' kit tal-għadd taċ-ċelloli 8 (Dojindo). Bħala kontroll, iċ-ċelloli HeLa ġew ittrattati b'5 μg/ml actinomycin D (Act D), li jinibixxi t-traskrizzjoni tal-RNA polymerase u jikkawża l-mewt taċ-ċelloli. L-analiżijiet twettqu fi tliet kopji. (e) Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli ta' E. coli. It-tkabbir ta' E. coli ġie analizzat billi tkejjel l-OD600. Bħala kontroll, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'50 μg/ml ampiċillina (Amp), li tinibixxi s-sintesi tal-ħajt taċ-ċelloli batteriċi. L-analiżijiet twettqu fi tliet kopji.
Biex niddeċifraw il-mekkaniżmu ta' azzjoni taċ-ċitotossiċità kkawżata minn komposti relatati mal-uramide, analizzajna mill-ġdid id-derivattivi tal-aċidu urbeniku b'effetti inibitorji moderati, kif muri fl-istampa. Kif muri fil-Figuri 2b, 6a, in-nebbieta mkabbra fuq pjanċi tal-agar li fihom konċentrazzjonijiet għoljin (200 μM) ta' aċidu urmotoniku 6 ipproduċew għeruq iqsar u mgħawġa lejn ix-xellug (θ = – 23.7 ± 6.1), filwaqt li n-nebbieta mkabbra fuq il-mezz ta' kontroll, in-nebbieta pproduċew għeruq kważi dritti (θ = – 3.8 ± 7.1). Dan it-tkabbir oblikwu karatteristiku huwa magħruf li jirriżulta minn disfunzjoni tal-mikrotubuli kortikali14,18. Konsistenti ma' din is-sejba, il-mediċini li jiddestabbilizzaw il-mikrotubuli disopyramide u oryzalin ikkaġunaw inklinazzjoni simili tal-għeruq fil-kundizzjonijiet tat-tkabbir tagħna (Figuri 2b, 6a). Fl-istess ħin, ittestjajna derivattivi tal-aċidu urmotoniku u għażilna diversi minnhom li, f'ċerti konċentrazzjonijiet, ikkaġunaw tkabbir oblikwu tal-għeruq. Il-komposti 8, 9, u 15 biddlu d-direzzjoni tat-tkabbir tal-għeruq b'75 μM, 50 μM, u 40 μM, rispettivament, li jindika li dawn il-komposti jistgħu jiddestabbilizzaw b'mod effettiv il-mikrotubuli (Fig. 2b, 6a). Ittestjajna wkoll l-aktar derivattiv qawwi tal-aċidu ursoliku, KAND 11, f'konċentrazzjoni aktar baxxa (15 µM) u sibna li l-applikazzjoni ta' KAND 11 inibixxiet it-tkabbir tal-għeruq u li d-direzzjoni tat-tkabbir tal-għeruq kienet irregolari, għalkemm kellhom it-tendenza li jinklinaw lejn ix-xellug (Figura C3). Minħabba li konċentrazzjonijiet ogħla ta' drogi li jiddestabbilizzaw il-mikrotubuli xi kultant jinibixxu t-tkabbir tal-pjanti aktar milli jikkawżaw inklinazzjoni tal-għeruq, sussegwentement ivvalutajna l-possibbiltà li KAND 11 jaffettwa l-mikrotubuli billi osservajna l-mikrotubuli kortikali fiċ-ċelloli epidermali tal-għeruq. L-immunoistokimika bl-użu ta' antikorpi anti-β-tubulin f'ċelloli epidermali ta' għeruq ta' nebbieta ttrattati b'25 μM KAND 11 uriet l-għajbien ta' kważi l-mikrotubuli kortikali kollha fiċ-ċelloli epidermali fiż-żona ta' elongazzjoni (Fig. 6b). Dawn ir-riżultati jindikaw li l-aċidu kumamotonik u d-derivattivi tiegħu jaġixxu direttament jew indirettament fuq il-mikrotubuli biex ifixkluhom u li dawn il-komposti huma inibituri ġodda tal-mikrotubuli.
L-aċidu ursoniku u d-derivattivi tiegħu jbiddlu l-mikrotubuli kortikali f'Arabidopsis thaliana. (a) Angolu ta' inklinazzjoni tal-għerq imkejjel fil-preżenza ta' diversi derivattivi tal-aċidu urmotoniku fil-konċentrazzjonijiet indikati. Ġew analizzati wkoll l-effetti ta' żewġ komposti magħrufa li jinibixxu l-mikrotubuli: disopiramide u oryzalin. L-inserzjoni turi l-istandard użat biex jitkejjel l-angolu tat-tkabbir tal-għerq. L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bit-trattament finta (test t, p< 0.05).n>19. Skala = 1 ċm. (b) Mikrotubuli kortikali f'ċelloli epidermali fiż-żona ta' elongazzjoni. Mikrotubuli f'għeruq ta' Arabidopsis Col tat-tip selvaġġ imkabbra fuq pjanċi MS b'25 μM KAND 11 jew mingħajru ġew viżwalizzati permezz ta' tebgħa immunoistokimika bl-użu ta' antikorpi primarji ta' β-tubulin u antikorpi sekondarji konjugati ma' Alexa Fluor. Skala = 10 µm. (ċ) Struttura mitotika tal-mikrotubuli fil-meristema tal-għerq. Il-mikrotubuli ġew viżwalizzati bl-użu ta' tebgħa immunoistokimika. Strutturi mitotiċi, inklużi żoni tal-profażi, magħżel, u fragmoplasti, ġew magħduda minn immaġini konfokali. Il-vleġeġ jindikaw strutturi mitotiċi tal-mikrotubuli. L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bit-trattament finta (test t, p< 0.05).n>9. L-iskala = 50 µm.
Għalkemm Ursa għandha l-abbiltà li tfixkel il-funzjoni tal-mikrotubuli, il-mekkaniżmu ta' azzjoni tagħha huwa mistenni li jkun differenti minn aġenti tipiċi ta' depopolimerizzazzjoni tal-mikrotubuli. Pereżempju, konċentrazzjonijiet ogħla ta' aġenti ta' depopolimerizzazzjoni tal-mikrotubuli bħal disopiramide u oryzalin jinduċu espansjoni anisotropika taċ-ċelloli epidermali, filwaqt li KAND 11 ma jagħmilx dan. Barra minn hekk, l-applikazzjoni konġunta ta' KAND 11 u disopiramide rriżultat f'rispons ikkombinat għat-tkabbir tal-għeruq indott minn disopiramide u ġiet osservata inibizzjoni tat-tkabbir indotta minn KAND 11 (Fig. S4). Analizzajna wkoll ir-rispons tal-mutant ipersensittiv disopiramide 1-1 (phs1-1) għal KAND 11. phs1-1 għandha mutazzjoni puntwali mhux kanonika tat-tubulin kinase u tipproduċi għeruq iqsar meta ttrattata b'disopiramide9,20. In-nebbieta mutanti phs1-1 imkabbra fuq mezz agar li fih KAND 11 kellhom għeruq iqsar simili għal dawk imkabbra fuq disopiramide (fig. S5).
Barra minn hekk, osservajna strutturi ta' mikrotubuli mitotiċi, bħal żoni tal-profażi, magħżel, u fragmoplasti, fil-meristema tal-għeruq tan-nebbieta ttrattati b'KAND 11. Konsistenti mal-osservazzjonijiet għal CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, ġie osservat tnaqqis sinifikanti fin-numru ta' mikrotubuli mitotiċi (Fig. .6c).
Biex nikkaratterizzaw iċ-ċitotossiċità ta' KAND 11 f'riżoluzzjoni subċellulari, ittrattajna ċ-ċelloli tas-sospensjoni tat-tabakk BY-2 b'KAND 11 u osservajna r-rispons tagħhom. L-ewwel żidna KAND 11 maċ-ċelloli BY-2 li jesprimu TagRFP-TUA6, li jimmarka l-mikrotubuli b'mod fluworexxenti, biex nivvalutaw l-effett ta' KAND 11 fuq il-mikrotubuli kortikali. Id-densità tal-mikrotubuli kortikali ġiet ivvalutata bl-użu tal-analiżi tal-immaġni, li kwantifikat il-perċentwal ta' pixels ċitoskeletali fost il-pixels ċitoplasmiċi. Ir-riżultati tal-assaġġ urew li wara trattament b'50 μM jew 100 μM KAND 11 għal siegħa, id-densità naqset b'mod sinifikanti għal 0.94 ± 0.74% jew 0.23 ± 0.28%, rispettivament, filwaqt li d-densità taċ-ċelloli ttrattati b'DMSO, ammontat għal 1.61 ± 0.34% (Fig. 7a). Dawn ir-riżultati huma konsistenti mal-osservazzjoni f'Arabidopsis li t-trattament KAND 11 jikkaġuna depolimizzazzjoni tal-mikrotubuli kortikali (Fig. 6b). Eżaminajna wkoll il-linja BY-2 b'filamenti tal-actina mmarkati b'GFP-ABD wara trattament bl-istess konċentrazzjoni ta' KAND 11 u osservajna li t-trattament b'KAND 11 ħassar il-filamenti tal-actina. It-trattament b'50 μM jew 100 μM KAND 11 għal siegħa naqqas b'mod sinifikanti d-densità tal-filament tal-actina għal 1.20 ± 0.62% jew 0.61 ± 0.26%, rispettivament, filwaqt li d-densità fiċ-ċelloli ttrattati bid-DMSO kienet ta' 1.69 ± 0.51% (Fig. 2). 7b). Dawn ir-riżultati jikkuntrastaw mal-effetti tal-propyzamide, li ma jaffettwax il-filamenti tal-actina, u latrunculin B, depolimerizzatur tal-actina li ma jaffettwax il-mikrotubuli (Figura S6 tal-Figura SI). Barra minn hekk, it-trattament b'coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, jew KAND 11 ma affettwax il-mikrotubuli fiċ-ċelloli HeLa (Figura S7 tal-Figura SI). Għalhekk, il-mekkaniżmu ta' azzjoni ta' KAND 11 huwa maħsub li huwa differenti minn dak ta' disruptors taċ-ċitoskeletru magħrufa. Barra minn hekk, l-osservazzjoni mikroskopika tagħna taċ-ċelloli BY-2 ittrattati b'KAND 11 żvelat il-bidu tal-mewt taċ-ċelloli waqt it-trattament b'KAND 11 u wriet li l-proporzjon ta' ċelloli mejta mtebbgħin b'Evans blue ma żdiedx b'mod sinifikanti wara 30 minuta ta' trattament b'KAND 11, filwaqt li wara 90 minuta ta' trattament b'50 μM jew 100 μM KAND, l-għadd ta' ċelloli mejta żdied għal 43.7% jew 80.1%, rispettivament (Fig. 7c). Meħuda flimkien, din id-dejta tindika li d-derivattiv ġdid tal-aċidu ursoliku KAND 11 huwa inibitur ċitoskeletali speċifiku għall-pjanti b'mekkaniżmu ta' azzjoni li qabel ma kienx magħruf.
KAND jaffettwa l-mikrotubuli kortikali, il-filamenti tal-actina, u l-vijabbiltà taċ-ċelloli BY-2 tat-tabakk. (a) Viżwalizzazzjoni tal-mikrotubuli kortikali fiċ-ċelloli BY-2 fil-preżenza ta' TagRFP-TUA6. Iċ-ċelloli BY-2 ittrattati b'KAND 11 (50 μM jew 100 μM) jew DMSO ġew eżaminati permezz ta' mikroskopija konfokali. Id-densità tal-mikrotubuli kortikali ġiet ikkalkulata minn mikrografi ta' 25 ċellula indipendenti. L-ittri jindikaw differenzi sinifikanti (test Tukey HSD, p< 0.05). Skala tal-iskala = 10 µm. (b) Filamenti tal-aktina kortikali f'ċelloli BY-2 viżwalizzati fil-preżenza ta' GFP-ABD2. Ċelloli BY-2 ittrattati b'KAND 11 (50 μM jew 100 μM) jew DMSO ġew eżaminati permezz ta' mikroskopija konfokali. Id-densità tal-filamenti tal-aktina kortikali ġiet ikkalkulata minn mikrografi ta' 25 ċellula indipendenti. L-ittri jindikaw differenzi sinifikanti (test Tukey HSD, p< 0.05). Skala tal-bar = 10 µm. (ċ) Osservazzjoni taċ-ċelloli mejta BY-2 permezz ta' tbajja' Evans blue. Iċ-ċelloli BY-2 ittrattati b'KAND 11 (50 μM jew 100 μM) jew DMSO ġew eżaminati b'mikroskopija b'kamp ċar. n=3. Skala tal-bar = 100 µm.
L-iskoperta u l-applikazzjoni ta’ prodotti naturali ġodda wasslu għal avvanzi sinifikanti f’diversi aspetti tal-ħajja tal-bniedem, inklużi l-mediċina u l-agrikoltura. Twettqet riċerka storika biex jinkisbu komposti utli minn riżorsi naturali. B’mod partikolari, l-aktinomiċeti huma magħrufa li huma utli bħala antibijotiċi antiparassitiċi għan-nematodi minħabba l-abbiltà tagħhom li jipproduċu diversi metaboliti sekondarji bħall-avermectin, il-kompost ewlieni tal-ivermectin u l-bleomycin u d-derivattivi tiegħu, użati mediċinali bħala aġent kontra l-kanċer21,22. Bl-istess mod, ġiet skoperta varjetà ta’ komposti erbiċidi mill-aktinomiċeti, li wħud minnhom diġà jintużaw kummerċjalment1,23. Għalhekk, l-analiżi tal-metaboliti tal-aktinomiċeti biex jiġu iżolati prodotti naturali b’attivitajiet bijoloġiċi mixtieqa hija kkunsidrata bħala strateġija effettiva. F’dan l-istudju, skoprejna kompost ġdid, coumamonamide, minn S. werraensis u sintetizzajnieh b’suċċess. L-aċidu ursoniku huwa intermedju sintetiku tal-urbenamide u d-derivattivi tiegħu. Jista’ jikkawża tidwir karatteristiku tal-għeruq, juri attività erbiċida moderata sa qawwija, u jagħmel ħsara diretta jew indiretta lill-mikrotubuli tal-pjanti. Madankollu, il-mekkaniżmu ta' azzjoni tal-aċidu urmotoniku jista' jkun differenti minn dak tal-inibituri tal-mikrotubuli eżistenti, peress li KAND 11 ifixkel ukoll il-filamenti tal-actina u jikkawża l-mewt taċ-ċelluli, u dan jissuġġerixxi mekkaniżmu regolatorju li bih l-aċidu urmotoniku u d-derivattivi tiegħu jinfluwenzaw firxa wiesgħa ta' strutturi ċitoskeletali.
Karatterizzazzjoni aktar dettaljata tal-aċidu urbenoniku se tgħin biex nifhmu aħjar il-mekkaniżmu ta' azzjoni tal-aċidu urbenoniku. B'mod partikolari, l-għan li jmiss huwa li tiġi evalwata l-abbiltà tal-aċidu ursoniku li jorbot ma' mikrotubuli mnaqqsa biex jiġi determinat jekk l-aċidu ursoniku u d-derivattivi tiegħu jaġixxux direttament fuq il-mikrotubuli u jiddepolimerizzawhomx, jew jekk l-azzjoni tagħhom tirriżultax f'destabilizzazzjoni tal-mikrotubuli. Barra minn hekk, fil-każ fejn il-mikrotubuli mhumiex mira diretta, l-identifikazzjoni tas-sit ta' azzjoni u l-miri molekulari tal-aċidu ursoniku fuq iċ-ċelloli tal-pjanti se tgħin biex nifhmu aktar il-proprjetajiet ta' komposti relatati u modi possibbli biex tittejjeb l-attività erbiċida. L-assaġġ tal-bijoattività tagħna żvela l-abbiltà ċitotossika unika tal-aċidu ursoniku fuq it-tkabbir ta' pjanti bħal Arabidopsis thaliana, tabakk u liverwort, filwaqt li la ċ-ċelloli E. coli u lanqas HeLa ma ġew affettwati. Ftit jew xejn tossiċità għaċ-ċelloli tal-annimali hija vantaġġ tad-derivattivi tal-aċidu ursoniku jekk jiġu żviluppati bħala erbiċidi għall-użu f'għelieqi agrikoli miftuħa. Tabilħaqq, peress li l-mikrotubuli huma strutturi komuni fl-ewkarjoti, l-inibizzjoni selettiva tagħhom fil-pjanti hija rekwiżit ewlieni għall-erbiċidi. Pereżempju, il-propyzamide, aġent depolimerizzanti tal-mikrotubuli li jingħaqad direttament mat-tubulina u jinibixxi l-polimerizzazzjoni, jintuża bħala erbiċida minħabba t-tossiċità baxxa tiegħu għaċ-ċelloli tal-annimali24. B'kuntrast mad-disopyramide, il-benzamidi relatati għandhom speċifiċitajiet ta' mira differenti. Minbarra l-mikrotubuli tal-pjanti, RH-4032 jew benzoxamide jinibixxu wkoll il-mikrotubuli taċ-ċelloli tal-annimali jew l-oomiċeti, rispettivament, u zalilamide jintuża bħala funġiċida minħabba l-fitotossiċità baxxa tiegħu25,26,27. L-ors li għadu kif ġie skopert u d-derivattivi tiegħu juru ċitotossiċità selettiva kontra l-pjanti, iżda ta' min jinnota li modifiki ulterjuri jistgħu jbiddlu l-ispeċifiċità tal-mira tagħhom, u potenzjalment jipprovdu derivattivi addizzjonali għall-kontroll ta' fungi patoġeniċi jew oomiċeti.
Il-proprjetajiet uniċi tal-aċidu urbeniku u d-derivattivi tiegħu huma utli għall-iżvilupp tagħhom bħala erbiċidi u l-użu tagħhom bħala għodod ta' riċerka. L-importanza taċ-ċitoskeletru fil-kontroll tal-forma taċ-ċelluli tal-pjanti hija rikonoxxuta b'mod wiesa'. Studji preċedenti wrew li l-pjanti evolvew mekkaniżmi kumplessi ta' organizzazzjoni tal-mikrotubuli kortikali billi kkontrollaw id-dinamika tal-mikrotubuli biex jikkontrollaw kif suppost il-morfoġenesi. Ġew identifikati numru kbir ta' molekuli responsabbli għar-regolazzjoni tal-attività tal-mikrotubuli, u r-riċerka relatata għadha għaddejja3,4,28. Il-fehim attwali tagħna tad-dinamika tal-mikrotubuli fiċ-ċelluli tal-pjanti ma jispjegax bis-sħiħ il-mekkaniżmi tal-organizzazzjoni tal-mikrotubuli kortikali. Pereżempju, għalkemm kemm id-disopiramide kif ukoll l-oryzalin jistgħu jiddepolimerizzaw il-mikrotubuli, id-disopiramide tikkawża distorsjoni severa tal-għeruq filwaqt li l-oryzalin għandu effett relattivament ħafif. Barra minn hekk, mutazzjonijiet fit-tubulina, li tistabbilizza l-mikrotubuli, tikkawża wkoll destrorotazzjoni fl-għeruq, filwaqt li l-paclitaxel, li jistabbilizza wkoll id-dinamika tal-mikrotubuli, ma jagħmilx dan. Għalhekk, l-istudju u l-identifikazzjoni tal-miri molekulari tal-aċidu ursoliku għandhom jipprovdu għarfien ġdid dwar ir-regolazzjoni tal-mikrotubuli kortikali tal-pjanti. Bl-istess mod, tqabbil futur ta' kimiċi li huma effettivi fil-promozzjoni ta' tkabbir distort, bħal disopyramide, u kimiċi inqas effettivi, bħal oryzalin jew kumamotoric acid, se jipprovdi indikazzjonijiet dwar kif iseħħ it-tkabbir distort.
Min-naħa l-oħra, ir-riarranġamenti ċitoskeletali relatati mad-difiża huma possibbiltà oħra biex tispjega ċ-ċitotossiċità tal-aċidu ursoniku. L-infezzjoni ta' patoġenu jew l-introduzzjoni ta' eliċitur fiċ-ċelloli tal-pjanti xi kultant tikkawża l-qerda taċ-ċitoskeletru u l-mewt sussegwenti taċ-ċelloli29. Pereżempju, ġie rrappurtat li l-kriptoksantina derivata mill-oomiċet tfixkel il-mikrotubuli u l-filamenti tal-aktina qabel il-mewt taċ-ċelloli tat-tabakk, simili għal dak li jiġri bit-trattament KAND30,31. Ix-xebh bejn ir-risponsi ta' difiża u r-risponsi ċellulari indotti mill-aċidu ursoniku wassalna biex nissoponu li dawn jattivaw proċessi ċellulari komuni, għalkemm huwa evidenti effett aktar mgħaġġel u aktar b'saħħtu tal-aċidu ursoniku milli l-kriptoksantina. Madankollu, studji wrew li t-tfixkil tal-filamenti tal-aktina jippromwovi l-mewt spontanja taċ-ċelloli, li mhux dejjem tkun akkumpanjata minn tfixkil tal-mikrotubuli29. Barra minn hekk, għad irid jara jekk il-patoġenu jew l-eliċitur jikkawżawx tkabbir mgħawweġ tal-għeruq, kif jagħmlu d-derivattivi tal-aċidu ursoniku. Għalhekk, l-għarfien molekulari li jgħaqqad ir-risponsi ta' difiża u ċ-ċitoskeletru huwa problema attraenti li għandha tiġi indirizzata. Billi jisfruttaw il-preżenza ta' komposti ta' piż molekulari baxx relatati mal-aċidu ursoniku, kif ukoll firxa ta' derivattivi b'potenzi varji, dawn jistgħu jipprovdu opportunitajiet biex jimmiraw lejn mekkaniżmi ċellulari mhux magħrufa.
Meħuda flimkien, l-iskoperta u l-applikazzjoni ta' komposti ġodda li jimmodulaw id-dinamika tal-mikrotubuli se jipprovdu metodi qawwija biex jindirizzaw il-mekkaniżmi molekulari kumplessi li fuqhom hija bbażata d-determinazzjoni tal-forma taċ-ċelluli tal-pjanti. F'dan il-kuntest, il-kompost żviluppat reċentement, l-aċidu urmotoniku, li jaffettwa l-mikrotubuli u l-filamenti tal-actina u jikkaġuna l-mewt taċ-ċelluli, jista' jipprovdi opportunità biex tiġi deċifrata l-konnessjoni bejn il-kontroll tal-mikrotubuli u dawn il-mekkaniżmi l-oħra. Għalhekk, l-analiżi kimika u bijoloġika bl-użu tal-aċidu urbenoniku se tgħinna nifhmu l-mekkaniżmi regolatorji molekulari li jikkontrollaw iċ-ċitoskeletru tal-pjanti.
Inokula S. werraensis MK493-CF1 fi flask Erlenmeyer ta' 500 mL b'baffled li fih 110 mL ta' mezz taż-żerriegħa li jikkonsisti minn 2% (w/v) galattożju, 2% (w/v) pejst Essence, 1% (w/v) kompożizzjoni Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) estratt tal-qamħirrun (KOGOSTCH Co., Ltd., Ġappun), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 u 0.2% CaCO3 f'ilma dejonizzat. (pH 7.4 qabel l-isterilizzazzjoni). Il-kulturi taż-żerriegħa ġew inkubati fuq shaker rotatorju (180 rpm) f'27°C għal jumejn. Kultivazzjoni tal-produzzjoni permezz ta' fermentazzjoni fi stat solidu. Il-kultura taż-żerriegħa (7 ml) ġiet trasferita fi flask K-1 ta' 500 ml li fih 40 g ta' mezz ta' produzzjoni li jikkonsisti minn 15 g ta' xgħir ippressat (MUSO Co., Ltd., Ġappun) u 25 g ta' ilma dejonizzat (pH mhux aġġustat qabel l-isterilizzazzjoni). Il-fermentazzjoni twettqet f'temperatura ta' 30°C fid-dlam għal 14-il jum. Il-materjal tal-fermentazzjoni ġie estratt b'40 ml/flixkun EtOH u ċċentrifugat (1500 g, 4°C, 10 min). Is-supernatant tal-kultura (60 ml) ġie estratt b'taħlita ta' 10% MeOH/EtOAc. Is-saff organiku ġie evaporat taħt pressjoni mnaqqsa biex jinkiseb residwu (59.5 mg), li ġie soġġett għal HPLC b'eluzzjoni ta' gradjent (0–10 minuti: 90%) fuq kolonna ta' fażi inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × tul 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuta: 90% H2O/CH3CN sa 70% H2O/CH3CN (gradjent), 35–45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuta: 90% H2O/EtOH sa 100% EtOH (gradjent (gradjent), 155–200 min: 100% EtOH) b'rata ta' fluss ta' 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) ġie iżolat bħala trab amorfu abjad.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valur kalkulat: 141.0659, valur imkejjel: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Iż-żerriegħa tal-Columbia (Col-0) inkisbet miċ-Ċentru tar-Riżorsi Bijoloġiċi tal-Arabidopsis (ABRC) bil-permess għall-użu fir-riċerka. Iż-żerriegħa Col-0 ġew propagati u miżmuma fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju tagħna u ntużaw bħala pjanti tat-tip selvaġġ tal-Arabidopsis. Iż-żerriegħa tal-Arabidopsis ġiet sterilizzata fil-wiċċ u kkultivata f'mezz Murashige u Skoog ta' nofs saħħa li kien fih 2% sukrożju (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) aċidu 2-(4-morfolino)etanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) u 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, f'23 °C u dawl kostanti. Iż-żerriegħa tal-mutant phs1-1 ġiet ipprovduta minn T. Hashimoto (Istitut tax-Xjenza u t-Teknoloġija ta' Nara).
Iż-żerriegħa tar-razza SR-1 ġiet ipprovduta minn T. Hashimoto (Istitut tax-Xjenza u t-Teknoloġija ta' Nara) u ntużat bħala pjanti tat-tabakk tat-tip selvaġġ. Iż-żerriegħa tat-tabakk ġiet sterilizzata fil-wiċċ u mxarrba f'ilma sterili għal tlett iljieli biex tippromwovi l-ġerminazzjoni, imbagħad tqiegħdet f'soluzzjoni ta' nofs saħħa li fiha 2% sukrożju, 0.05% (w/v) MES, u 0.8% gomma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. u Skoog medium) b'pH 5.7 u inkubata f'23°C taħt dawl kostanti.
Ir-razza Tak-1 ġiet ipprovduta minn T. Kohchi (Università ta' Kyoto) u ntużat bħala l-unità sperimentali standard għall-istudju tal-liverwort. Il-Gemma nkisbet minn pjanti kkultivati sterilizzati u mbagħad tqiegħdet fuq mezz Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) li kien fih 1% sukrożju u 0.3% gomma gellan u ġiet inkubata f'temperatura ta' 23°C taħt dawl kontinwu.
Iċ-ċelloli tat-tabakk BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ġew ipprovduti minn S. Hasezawa (Università ta' Tokyo). Iċ-ċelloli BY-2 ġew dilwiti 95 darba f'mezz Linsmeier u Skoog modifikat u supplimentati kull ġimgħa b'2,4-diklorofenossiaċetiku 32. Is-sospensjoni taċ-ċelloli tħalltet fuq shaker rotatorju b'130 rpm f'27°C fid-dlam. Aħsel iċ-ċelloli b'10 darbiet il-volum ta' mezz frisk u erġa' ssospendi fl-istess mezz. Linji taċ-ċelloli transġeniċi BY-2 li jesprimu b'mod stabbli l-markatur tal-mikrotubuli TagRFP-TUA6 jew il-markatur tal-filament tal-actina GFP-ABD2 taħt il-promotur tal-virus tal-mużajk tal-pastard 35S ġew iġġenerati kif deskritt33,34,35. Dawn il-linji taċ-ċelloli jistgħu jinżammu u jiġu sinkronizzati bl-użu ta' proċeduri simili għal dawk użati għal-linja taċ-ċelloli BY-2 oriġinali.
Iċ-ċelloli HeLa ġew ikkultivati f'Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) supplimentat b'10% serum bovin fetali, 1.2 U/ml peniċillina, u 1.2 μg/ml streptomycin f'inkubatur ta' 37°C b'5% CO2.
L-esperimenti kollha deskritti f'dan il-manuskritt twettqu skont ir-regolamenti u l-linji gwida Ġappuniżi dwar il-bijosigurtà.
Il-komposti ġew maħlula f'dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) bħala soluzzjonijiet stokk u dilwiti f'mezz MS għal Arabidopsis u tabakk jew mezz Gamborg B5 għal liverwort. Għall-assaġġ tal-inibizzjoni tat-tkabbir tal-għeruq, aktar minn 10 żrieragħ għal kull pjanċa nżergħu fuq mezz agar li fih il-komposti indikati jew DMSO. Iż-żrieragħ ġew inkubati f'kamra tat-tkabbir għal 7 ijiem. In-nebbieta ġew fotografati u tkejjel it-tul tal-għeruq. Għall-assaġġ tal-ġerminazzjoni tal-Arabidopsis, 48 żerriegħa għal kull pjanċa nżergħu fuq mezz agar li fih 200 μM kompost jew DMSO. Iż-żrieragħ tal-Arabidopsis tkabbru f'kamra tat-tkabbir u n-numru ta' nebbieta ġerminati ngħadd 7 ijiem wara l-ġerminazzjoni (dag). Għall-assaġġ tal-ġerminazzjoni tat-tabakk, 24 żerriegħa għal kull pjanċa nżergħu fuq mezz agar li fih 200 μM KAND jew DMSO. Iż-żrieragħ tat-tabakk tkabbru f'kamra tat-tkabbir u n-numru ta' nebbieta ġerminati ngħadd wara 14-il jum. Għall-assaġġ tal-inibizzjoni tat-tkabbir tal-liverwort, 9 embrijuni minn kull pjanċa tqiegħdu fuq mezz tal-agar li kien fih il-konċentrazzjonijiet indikati ta' KAND jew DMSO u ġew inkubati f'kamra tat-tkabbir għal 14-il jum.
Uża nebbieta mtebbgħin b'5 mg/ml propidium iodide (PI) biex tivviżwalizza l-organizzazzjoni tal-meristem tal-għeruq. Is-sinjali PI ġew osservati permezz ta' mikroskopija tal-fluworexxenza bl-użu ta' mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-lejżer TCS SPE (Leica Microsystems).
It-tebgħa istokimika tal-għeruq b'β-glucuronidase (GUS) twettqet skont il-protokoll deskritt minn Malami u Benfey36. In-nebbieta ġew iffissati f'90% aċetun matul il-lejl, imtebbgħin b'0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid f'buffer GUS għal siegħa u mqiegħda f'soluzzjoni ta' kloraldeid idratat (8 g kloral idrat, 2 ml ilma u 1 ml gliċerol) u osservati permezz ta' mikroskopija ta' kuntrast ta' interferenza differenzjali bl-użu ta' mikroskopju Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
L-angoli tal-għeruq tkejlu fuq nebbieta ta’ 7 ijiem imkabbra fuq pjanċi mqiegħda vertikalment. Kejjel l-angolu tal-għerq mid-direzzjoni tal-vettur tal-gravità kif deskritt fil-pass 6.
L-arranġament tal-mikrotubuli kortikali ġie osservat kif deskritt, b'modifiki żgħar għall-protokoll 37. Antikorp anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) u IgG anti-ġrieden konjugat ma' Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) intużaw bħala antikorpi primarji u sekondarji f'dilwizzjonijiet ta' 1:1000 u 1:100, rispettivament. L-immaġini tal-fluworexxenza nkisbu bl-użu ta' mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-lejżer TCS SPE (Leica Microsystems). Akkwista immaġini Z-stack u oħloq projezzjonijiet ta' intensità massima skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
L-analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli HeLa twettaq bl-użu taċ-Cell Counting Kit 8 (Dojindo) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
It-tkabbir ta' E. coli DH5α ġie analizzat billi tkejlet id-densità taċ-ċelluli fil-kultura bl-użu ta' spettrofotometru f'600 nm (OD600).
L-organizzazzjoni ċitoskeletali f'ċelloli transġeniċi BY-2 ġiet osservata bl-użu ta' mikroskopju fluworexxenti mgħammar b'apparat ta' skannjar konfokali CSU-X1 (Yokogawa) u kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Id-densità ċitoskeletali ġiet ivvalutata permezz ta' analiżi tal-immaġni, li kwantifikat il-perċentwal ta' pixels ċitoskeletali fost il-pixels ċitoplasmiċi f'immaġnijiet konfokali bl-użu tas-softwer ImageJ kif deskritt38,39.
Biex tiġi skoperta l-mewt taċ-ċelluli fiċ-ċelluli BY-2, alikwot tas-sospensjoni taċ-ċelluli ġie inkubat b'0.05% Evans blue għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra. It-tebgħa selettiva ta' Evans blue taċ-ċelluli mejta tiddependi fuq l-estrużjoni taż-żebgħa minn ċelluli vijabbli mill-membrana tal-plażma intatta40. Iċ-ċelluli mtebbgħin ġew osservati bl-użu ta' mikroskopju b'kamp ċar (BX53, Olympus).
Iċ-ċelloli HeLa tkabbru f'DMEM supplimentat b'10% FBS f'inkubatur umidifikat f'temperatura ta' 37°C u 5% CO2. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'100 μM KAND 11, aċidu kumamonamiku 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), jew 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) għal 6 sigħat f'temperatura ta' 37°C. Iċ-ċelloli ġew iffissati b'MetOH għal 10 minuti u mbagħad b'aċetat għal 5 minuti f'temperatura tal-kamra. Iċ-ċelloli ffissati ġew inkubati b'antikorp primarju β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) dilwit f'0.5% BSA/PBS għal sagħtejn, maħsula 3 darbiet b'TBST, u mbagħad inkubati b'antikorp tal-mogħża Alexa Fluor. 488 siegħa. – IgG tal-ġrieden (Thermo Fisher Scientific: A11001) u 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilwit f'0.5% BSA/PBS. Wara l-ħasil bit-TBST tliet darbiet, iċ-ċelloli mtebbgħin ġew osservati fuq mikroskopju invertit Nikon Eclipse Ti-E. L-immaġnijiet inqabdu b'kamera Hamamatsu ORCA-R2 CCD imkessħa bl-użu tas-softwer MetaMorph (Molecular Devices).
Ħin tal-posta: 17 ta' Ġunju 2024