Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar riżultati, nirrakkomandaw li tuża verżjoni aktar ġdida tal-browser tiegħek (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, qed nuru s-sit mingħajr stil jew JavaScript.
L-iskoperta u l-użu ta 'benefiċċju ta' prodotti naturali jistgħu jgħinu biex itejbu l-ħajja tal-bniedem.Il-kimiċi inibitorji tat-tkabbir tal-pjanti jintużaw ħafna bħala erbiċidi biex jikkontrollaw il-ħaxix ħażin.Minħabba l-ħtieġa li jintużaw tipi differenti ta 'erbiċidi, hemm bżonn li jiġu identifikati komposti b'mekkaniżmi ġodda ta' azzjoni.F'dan l-istudju, skoprejna kompost ġdid ta 'N -alkoxypyrrole, coumamonamide, minn Streptomyces werraensis MK493-CF1 u stabbilixxa l-proċess sħiħ ta' sinteżi.Permezz ta’ analiżi ta’ attività bijoloġika, skoprejna li l-aċidu urs-monoamic huwa intermedju sintetiku ta’ urs-monoamide u potenzjalinibitur tat-tkabbir tal-pjanti.Barra minn hekk, żviluppajna diversi derivattivi tal-aċidu urbenoniku, inkluż id-derivattiv urbenyloxy (UDA), li għandu attività erbiċida għolja mingħajr ma jaffettwa b'mod negattiv it-tkabbir taċ-ċelloli HeLa.Sibna wkoll li d-derivattivi tal-aċidu urmotonic ifixklu l-mikrotubuli tal-pjanti;barra minn hekk, KAND jaffettwa l-filamenti ta 'l-actin u jinduċi mewt taċ-ċelluli;Dawn l-effetti multidimensjonali huma differenti minn dawk ta 'inibituri mikrotubuli magħrufa u jissuġġerixxu mekkaniżmu ġdid ta' azzjoni għall-aċidu ursoniku, li jirrappreżenta vantaġġ importanti fl-iżvilupp ta 'erbiċidi ġodda.
L-iskoperta u l-applikazzjoni prattika ta 'prodotti naturali ta' benefiċċju u d-derivattivi tagħhom hija mezz biex tittejjeb il-kwalità tal-ħajja tal-bniedem.Metaboliti sekondarji prodotti minn mikro-organiżmi, pjanti u insetti wasslu għal avvanzi kbar fil-mediċina u l-agrikoltura.Ħafna antibijotiċi u mediċini kontra l-lewkimja ġew żviluppati minn prodotti naturali.Barra minn hekk, diversi tipi tapestiċidi, fungiċidi u erbiċidi huma estratti minn dawn il-prodotti naturali għall-użu fl-agrikoltura.B'mod partikolari, l-erbiċidi għall-kontroll tal-ħaxix ħażin huma għodda importanti biex jiżdiedu r-rendimenti tal-għelejjel fl-agrikoltura moderna, u diversi tipi ta 'komposti diġà huma użati kummerċjalment.Diversi proċessi ċellulari fil-pjanti, bħall-fotosintesi, il-metaboliżmu tal-aċidu amminiku, is-sintesi tal-ħajt taċ-ċelluli, ir-regolamentazzjoni tal-mitosi, is-sinjalar tal-fitoormoni, jew is-sintesi tal-proteini, huma meqjusa bħala miri tipiċi tal-erbiċidi.Komposti li jinibixxu l-funzjoni tal-mikrotubuli huma klassi komuni ta 'erbiċidi li jaffettwaw it-tkabbir tal-pjanti billi jaffettwaw ir-regolamentazzjoni mitotika2.
Il-mikrotubuli huma komponenti taċ-ċitoskeletru u huma kkonservati ħafna fiċ-ċelloli ewkarjotiċi.L-eterodimer tat-tubulina jikkonsisti minn α-tubulin u β-tubulin li jiffurmaw protofilamenti lineari tal-mikrotubuli, bi 13-il protofilament li jiffurmaw struttura ċilindrika.Il-mikrotubuli għandhom rwoli multipli fiċ-ċelloli tal-pjanti, inkluż id-determinazzjoni tal-forma taċ-ċelluli, id-diviżjoni taċ-ċelluli u t-trasport intraċellulari3,4.Iċ-ċelloli tal-pjanti fihom mikrotubuli taħt il-membrana tal-plażma interphase, u dawn l-hekk imsejħa mikrotubuli kortikali huma maħsuba li jikkontrollaw l-organizzazzjoni ta 'microfibrils taċ-ċelluloża permezz tar-regolamentazzjoni ta' kumplessi ta 'cellulose synthase4,5.Mikrotubuli kortikali ta 'ċelluli epidermali ta' l-għeruq, preżenti fiż-żona ta 'titwil rapidu tal-ponta ta' l-għerq, jinsabu lateralment, u l-microfibers taċ-ċelluloża jsegwu dawn il-mikrotubuli u jillimitaw id-direzzjoni ta 'espansjoni taċ-ċelluli, u b'hekk jippromwovu t-titwil anisotropiku taċ-ċelluli.Għalhekk, il-funzjoni tal-mikrotubuli hija relatata mill-qrib mal-morfoloġija tal-pjanti.Sostituzzjonijiet ta 'aċidi amminiċi fil-ġeni li jikkodifikaw tubulin jikkawżaw skew ta' arrays mikrotubuli kortikali u tkabbir fuq in-naħa tax-xellug jew tal-lemin f'Arabidopsis 6,7.Bl-istess mod, mutazzjonijiet fil-proteini assoċjati mal-mikrotubuli li jirregolaw id-dinamika tal-mikrotubuli jistgħu wkoll iwasslu għal tkabbir ta 'għeruq mgħawġa8,9,10,11,12,13.Barra minn hekk, it-trattament b'erbiċidi li jfixklu l-mikrotubuli bħal disopyramide, magħruf ukoll bħala pretilachlor, jikkawża wkoll tkabbir ta 'għeruq oblikwu fuq in-naħa tax-xellug14.Din id-dejta tindika li r-regolamentazzjoni preċiża tal-funzjoni tal-mikrotubuli hija kritika għad-determinazzjoni tad-direzzjoni tat-tkabbir tal-pjanti.
Ġew skoperti diversi tipi ta 'inibituri tal-mikrotubuli, u dawn il-mediċini għamlu kontributi sinifikanti għar-riċerka ċitoskeletali, kif ukoll għall-agrikoltura u l-mediċina2.B'mod partikolari, oryzalin, komposti ta 'dinitroaniline, disopyramide, komposti relatati ma' benzamide, u l-analogi tagħhom jistgħu jinibixxu l-funzjoni tal-mikrotubuli u b'hekk jinibixxu t-tkabbir tal-pjanti.Għalhekk, huma użati ħafna bħala erbiċidi.Madankollu, peress li l-mikrotubuli huma komponent importanti taċ-ċelloli tal-pjanti u tal-annimali, ħafna mill-inibituri tal-mikrotubuli huma ċitotossiċi għaż-żewġ tipi ta 'ċelluli.Għalhekk, minkejja l-utilità rikonoxxuta tagħhom bħala erbiċidi, numru limitat ta 'aġenti antimikrotubuli jintużaw għal skopijiet prattiċi.
Streptomyces huwa ġeneru tal-familja Streptomyces, li jinkludi batterji aerobiċi, gram-pożittivi, filamentożi u huwa magħruf ħafna għall-kapaċità tiegħu li jipproduċi firxa wiesgħa ta 'metaboliti sekondarji.Għalhekk, huwa meqjus bħala wieħed mill-aktar sorsi importanti ta 'prodotti naturali bijoloġikament attivi ġodda.Fl-istudju attwali, skoprejna kompost ġdid imsejjaħ coumamonamide, li kien iżolat minn Streptomyces werraensis MK493-CF1 u S. werraensis ISP 5486. Bl-użu ta 'analiżi spettrali u analiżi spettrali sħiħa, l-istruttura ta' coumamonamide kienet ikkaratterizzata u l-iskeletru uniku tiegħu ta 'N-alkoxypyrrole. ġie determinat.sintesi.L-aċidu ursmoniku, intermedju sintetiku ta 'ursmonoamide u d-derivattivi tiegħu, instab li jinibixxi t-tkabbir u l-ġerminazzjoni tal-pjanta mudell popolari Arabidopsis thaliana.Fi studju ta 'relazzjoni struttura-attività, sibna li kompost b'C9 modifikat għal aċidu ursoniku, imsejjaħ derivattiv nonyloxy ta' aċidu ursoniku (KAND), isaħħaħ b'mod sinifikanti l-effett inibitorju fuq it-tkabbir u l-ġerminazzjoni.Notevolment, l-inibitur tat-tkabbir tal-pjanti li għadu kif ġie skopert affettwa wkoll it-tkabbir tat-tabakk u l-liverwort u ma kienx ċitotossiku għall-batterja jew iċ-ċelloli HeLa.Barra minn hekk, xi derivattivi ta 'aċidu urmotoniku jinduċu fenotip ta' għerq distort, li jimplika li dawn id-derivattivi jaffettwaw direttament jew indirettament il-mikrotubuli.B'mod konsistenti ma 'din l-idea, l-osservazzjonijiet tagħna ta' mikrotubuli ttikkettjati jew immunoistokimikament jew bi proteini fluworexxenti jindikaw li t-trattament KAND jiddepolimerizza l-mikrotubuli.Barra minn hekk, it-trattament b'derivattivi tal-aċidu kumamotoniku ħarbat il-mikrofilamenti tal-actin.Għalhekk, skoprejna inibitur ġdid tat-tkabbir tal-pjanti li l-mekkaniżmu uniku ta 'azzjoni tiegħu jinvolvi l-qerda taċ-ċitoskeletru.
Strain MK493-CF1 kien iżolat mill-ħamrija f'Shinagawa-ku, Tokyo.Strain MK493-CF1 iffurmat miċelju stromali b'fergħat tajjeb.Is-sekwenza parzjali tal-ġene RNA ribosomal 16S (1422 bp) ġiet iddeterminata.Din ir-razza hija simili ħafna għal S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: razza tipika, 99.93%).Abbażi ta 'dan ir-riżultat, ġie determinat li din ir-razza kienet relatata mill-qrib mat-tip ta' razza ta 'S. werraensis.Għalhekk, provviżorjament semmejna din ir-razza S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T jipproduċi wkoll l-istess komposti bijoattivi.Peress li kien hemm ftit riċerka bikrija biex jinkisbu prodotti naturali minn dan il-mikroorganiżmu, saret aktar riċerka kimika.Wara l-kultivazzjoni ta 'S. werraensis MK493-CF1 fuq medju tax-xgħir permezz ta' fermentazzjoni fi stat solidu fi 30 ° C għal 14-il jum, il-medju ġie estratt b'50% EtOH.60 ml ta 'kampjun kien imnixxef biex jinkisbu 59.5 mg ta' estratt mhux raffinat.L-estratt mhux raffinat kien soġġett għal HPLC ta 'fażi inversa biex jagħti N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, jismu coumamonamide, 36.0 mg).L-ammont totali ta '1 huwa madwar 60% tal-estratt mhux raffinat.Għalhekk, iddeċidejna li nistudjaw fid-dettall il-proprjetajiet ta 'kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 huwa trab amorfu abjad u spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (HRESIMS) tikkonferma C6H8N2O2 (Fig. 1).Il-framment tal-pirrol C2-sostitut ta' dan il-kompost huwa kkaratterizzat minn δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH fi spettru 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) u δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), u l-ispettru 13C NMR juri l-preżenza ta 'erba' atomi tal-karbonju sp2.Il-preżenza ta 'grupp amide fil-pożizzjoni C2 ġiet evalwata permezz ta' korrelazzjoni HMBC mill-proton C-3 għall-karbonju amide carbonyl f'δC 161.1.Barra minn hekk, il-qċaċet 1 H u 13 C NMR f'δH 4.10 (3H, S) u δC 68.3 jindikaw il-preżenza ta 'gruppi N-metossi fil-molekula.Għalkemm il-pożizzjoni korretta tal-grupp methoxy kienet għadha ma ġietx determinata bl-użu ta 'analiżi spettroskopika bħal spettroskopija tad-differenza msaħħa u abbrevjazzjoni Overhauser nukleari (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide sar l-ewwel kompost kandidat.
Biex tiddetermina l-istruttura korretta ta '1, saret sinteżi totali (Fig. 2a).It-trattament ta '2-aminopyridine 2 disponibbli kummerċjalment b'm-CPBA irriżulta fl-N-oxide 3 korrispondenti f'rendiment kwantitattiv.Wara t-2-aminoazidation ta '2, ir-reazzjoni ta' ċiklokondensazzjoni deskritta minn Abramovich twettqet f'benżina f'90 ° C biex tikseb l-1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 mixtieq fi grammi.Veloċità 60% (żewġ stadji).15,16.Il-metilazzjoni u l-idroliżi ta '4 imbagħad taw aċidu 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (imsejjaħ "aċidu cumotonic", 6) b'rendiment tajjeb (70%, żewġ passi).Fl-aħħarnett, amidazzjoni permezz tal-klorur tal-aċidu intermedju 6 bl-użu ta 'ammonja milwiema tat Kumamoto amide 1 f'rendiment ta' 98%.Id-dejta spettrali kollha ta 'sintetizzata 1 kienet simili għal iżolat 1, għalhekk l-istruttura ta' 1 ġiet iddeterminata;
Sintesi ġenerali u analiżi tal-attività bijoloġika ta 'urbenamide u aċidu urbeniku.(a) Sintesi totali ta' Kumamoto amide.(b) In-nebbieta ta' Arabidopsis Columbia (Col) tat-tip selvaġġ ta' sebat ijiem tkabbru fuq pjanċi Murashige u Skoog (MS) li kien fihom coumamonamide 6 jew coumamonamide 1 fil-konċentrazzjonijiet indikati.Skala bar = 1 ċm.
L-ewwel, aħna vvalutajna l-attivitajiet bijoloġiċi ta 'urbenamide u l-intermedji tiegħu għall-kapaċità tagħhom li jimmodulaw it-tkabbir tal-pjanti.Żidna diversi konċentrazzjonijiet ta’ ursmonamide 1 jew ursmonic acid 6 ma’ MS agar medium u kkultivati Arabidopsis thaliana nebbieta fuq dan il-mezz.Dawn l-assaġġi wrew li konċentrazzjonijiet għoljin (500 μM) ta '6 inibixxu t-tkabbir ta' l-għeruq (Fig. 2b).Sussegwentement, iġġenerajna diversi derivattivi billi ssostitwixxiet il-pożizzjoni N1 ta '6 u wettaqna studji dwar ir-relazzjoni struttura-attività fuqhom (il-proċess ta' sinteżi analoga huwa deskritt fl-Informazzjoni ta 'Appoġġ (SI)).In-nebbieta ta 'Arabidopsis tkabbru fuq medju li kien fih derivattivi ta' aċidu ursoniku 50 μM, u tkejjel it-tul ta 'l-għeruq.kif muri fuq l-istampa.Kif muri fil-Figuri 3a, b, u S1, aċidi coumamo għandhom tulijiet differenti ta 'ktajjen alkoxy lineari (9, 10, 11, 12, u 13) jew ktajjen alkoxy kbar (15, 16, u 17) fil-pożizzjoni N1.Id-derivattivi wrew inibizzjoni sinifikanti tat-tkabbir tal-għeruq.Barra minn hekk, sibna li l-applikazzjoni ta '200 μM 10, 11, jew 17 inibit il-ġerminazzjoni (Figuri 3c u S2).
Studju tar-relazzjoni struttura-attività ta 'Kumamoto amide u komposti relatati.(a) Struttura u skema ta' sinteżi ta' analogi.(b) Kwantifikazzjoni tat-tul ta' l-għeruq ta' nebbieta ta' 7 ijiem imkabbra fuq medium MS bi jew mingħajr derivattivi ta' coumamonamide 50 μM.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bi trattament simulat (test t, p< 0.05).n>18. Id-dejta tintwera bħala medja ± SD.nt tfisser "mhux ittestjat" minħabba li aktar minn 50% taż-żrieragħ ma ġerminawx.(c) Kwantifikazzjoni tar-rata tal-ġerminazzjoni taż-żrieragħ ittrattati inkubati għal 7 ijiem f'MS medium bi jew mingħajr 200 μM cumamonamide u komposti relatati.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bi trattament sham (test chi-square).n=96.
Interessanti, iż-żieda ta 'ktajjen tal-ġenb alkil itwal minn C9 naqqset l-attività inibitorja, li tissuġġerixxi li l-komposti relatati mal-aċidu kumamotoic jeħtieġu ktajjen tal-ġenb ta' ċertu daqs biex juru l-attività bijoloġika tagħhom.
Minħabba li l-analiżi tar-relazzjoni bejn l-istruttura u l-attività wriet li C9 ġie mmodifikat għal aċidu ursoniku u d-derivat nonyloxy ta 'aċidu ursoniku (minn hawn 'il quddiem imsejjaħ KAND 11) kien l-aktar inibitur effettiv tat-tkabbir tal-pjanti, wettaqna karatterizzazzjoni aktar dettaljata ta' KAND 11. Trattament ta 'Arabidopsis b'50 μM KAND 11 kważi kompletament ipprevjeniet il-ġerminazzjoni, filwaqt li konċentrazzjonijiet aktar baxxi (40, 30, 20, jew 10 μM) ta 'KAND 11 inibixxu t-tkabbir tal-għeruq b'mod dipendenti mid-doża (Fig. 4a, b).Biex tittestja jekk KAND 11 taffettwax il-vijabbiltà tal-meristem ta 'l-għeruq, eżaminajna meristemi ta' l-għeruq imtebbgħin bil-jodur tal-propidju (PI) u kejlna d-daqs taż-żona tal-meristem.Id-daqs tal-meristem ta 'nebbieta mkabbra fuq medju li fih 25 μM KAND-11 kien 151.1 ± 32.5 μm, filwaqt li d-daqs tal-meristem ta' nebbieta mkabbra fuq mezz ta 'kontroll li fih DMSO kien 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d) , li jindika li KAND-11 jerġa 'jġib l-attività ċellulari.tixrid.Meristema tal-għeruq.B'mod konsistenti ma 'dan, it-trattament KAND 11 naqqas l-ammont ta' markatur tad-diviżjoni taċ-ċelluli CDKB2; 1p:: CDKB2; sinjal 1-GUS fil-meristem tal-għeruq (Fig. 4e) 17 .Dawn ir-riżultati jindikaw li KAND 11 jinibixxi t-tkabbir ta 'l-għeruq billi jnaqqas l-attività ta' proliferazzjoni taċ-ċelluli.
Analiżi tal-effett inibitorju tad-derivattivi tal-aċidu urbenoniku (derivattivi urbenyloxy) fuq it-tkabbir.(a) Nebbieta Col tat-tip selvaġġ ta' 7 ijiem imkabbra fuq pjanċi MS bil-konċentrazzjonijiet indikati ta' KAND 11. Skala bar = 1 ċm.(b) Kwantifikazzjoni tat-tul ta' l-għerq.L-ittri jindikaw differenzi sinifikanti (Tukey HSD test, p< 0.05).n>16. Id-dejta tintwera bħala medja ± SD.(c) Mikroskopija konfokali ta' għeruq Col tat-tip selvaġġ imtebbgħin bil-jodu tal-propidju mkabbra fuq pjanċi MS bi jew mingħajr 25 μM KAND 11. Il-parentesi bojod jindikaw meristem ta' l-għeruq.Skala bar = 100 µm.(d) Kwantifikazzjoni tad-daqs tal-meristem tal-għeruq (n = 10 sa 11).Id-differenzi statistiċi ġew determinati bl-użu tat-test (p< 0.05).Il-vireg jirrappreżentaw id-daqs medju tal-meristem.(e) Mikroskopija ta' kuntrast ta' interferenza differenzjali (DIC) ta' meristem ta' għerq li jkun fih il-kostrutt CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS imtebba' u mtebbgħin fuq nebbieta ta' 5 ijiem imkabbra fuq pjanċi MS bi jew mingħajr analiżi KAND ta' 25 µM.
Il-fitotossiċità ta 'KAND 11 ġiet ittestjata aktar bl-użu ta' pjanta dikotiledona oħra, tabakk (Nicotiana tabacum), u organiżmu mudell ewlieni tal-pjanti tal-art, liverwort (Marchantia polymorpha).Bħal fil-każ ta 'Arabidopsis, in-nebbieta tat-tabakk SR-1 imkabbra fuq medju li fih 25 μM KAND 11 ipproduċew għeruq iqsar (Fig. 5a).Barra minn hekk, 40 minn 48 żerriegħa ġerminaw fuq pjanċi li fihom 200 μM KAND 11, filwaqt li t-48 żerriegħa kollha ġerminaw fuq midja ttrattata finta, li jindika li konċentrazzjonijiet ogħla ta 'KAND kienu sinifikanti (p< 0.05;chi test -square) inibixxi l-ġerminazzjoni tat-tabakk.(Fig. 5b).Barra minn hekk, il-konċentrazzjoni ta 'KAND 11 li inibixxi t-tkabbir batterjali fil-liverwort kienet simili għall-konċentrazzjoni effettiva f'Arabidopsis (Fig. 5c).Dawn ir-riżultati jindikaw li KAND 11 jista 'jinibixxi t-tkabbir ta' varjetà ta 'pjanti.Imbagħad investigajna ċ-ċitotossiċità possibbli ta 'komposti relatati mal-monoamide tal-ors f'organiżmi oħra, jiġifieri ċelluli HeLa tal-bniedem u razza Escherichia coli DH5α, bħala rappreżentanti ta' ċelloli ogħla tal-annimali u tal-batterja, rispettivament.F'serje ta 'analiżi ta' proliferazzjoni taċ-ċelluli, osservajna li coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, u KAND 11 ma affettwawx it-tkabbir ta 'ċelloli HeLa jew E. coli f'konċentrazzjonijiet ta' 100 μM (Fig. 5d, e).
Inibizzjoni tat-tkabbir ta 'KAND 11 f'organiżmi mhux Arabidopsis.(a) Nebbieta tat-tabakk SR-1 tat-tip selvaġġ ta' ġimgħatejn tkabbru fuq pjanċi MS pożizzjonati vertikalment li fihom 25 μM KAND 11. (b) Nebbieta tat-tabakk SR-1 tat-tip selvaġġ ta' ġimgħatejn tkabbru fuq pożizzjonat orizzontalment Pjanċi MS li fihom 200 μM KAND 11. (c) Blanzuni tal-liverwort Tak-1 tat-tip selvaġġ ta' ġimgħatejn imkabbra fuq pjanċi Gamborg B5 bil-konċentrazzjonijiet indikati ta' KAND 11. Vleġeġ ħomor jindikaw spori li waqfu jikbru fl-inkubazzjoni ta' ġimgħatejn. perjodu.(d) Assaġġ tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli taċ-ċelloli HeLa.In-numru ta 'ċelluli vijabbli tkejjel f'intervalli ta' ħin fissi bl-użu ta 'kit ta' għadd ta 'ċelluli 8 (Dojindo).Bħala kontroll, iċ-ċelloli HeLa ġew ittrattati b'5 μg/ml actinomicin D (Att D), li jinibixxi t-traskrizzjoni tal-RNA polymerase u jikkawża mewt taċ-ċelluli.L-analiżi saru fi tliet kopji.(e) Assaġġ tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli E. coli.It-tkabbir ta 'E. coli ġie analizzat billi tkejjel OD600.Bħala kontroll, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'50 μg/ml ampicillin (Amp), li jinibixxi s-sintesi tal-ħajt taċ-ċellula batterjali.L-analiżi saru fi tliet kopji.
Biex niddeċifraw il-mekkaniżmu ta 'azzjoni taċ-ċitotossiċità kkawżata minn komposti relatati ma' uramide, aħna analizzajna mill-ġdid derivattivi ta 'aċidu urbeniku b'effetti inibitorji moderati.kif muri fuq l-istampa.Kif muri fil-Figuri 2b, 6a, nebbieta mkabbra fuq pjanċi tal-agar li fihom konċentrazzjonijiet għoljin (200 μM) ta 'aċidu urmotoniku 6 ipproduċew għeruq iqsar u mgħawġa lejn ix-xellug (θ = – 23.7 ± 6.1), filwaqt li ta' nebbieta mkabbra fuq il-mezz ta 'kontroll, il- nebbieta pproduċew għeruq kważi dritti (θ = – 3.8 ± 7.1).Dan it-tkabbir oblikwu karatteristika huwa magħruf li jirriżulta minn disfunzjoni tal-mikrotubuli kortikali14,18.B'mod konsistenti ma 'din is-sejba, il-mediċini li jiddistabbilizzaw il-mikrotubuli disopyramide u oryzalin wasslu għal inklinazzjoni ta' għerq simili taħt il-kundizzjonijiet tat-tkabbir tagħna (Figuri 2b, 6a).Fl-istess ħin, aħna ttestjaw derivattivi ta 'aċidu urmotoniku u għażilna bosta minnhom li, f'ċerti konċentrazzjonijiet, indott tkabbir ta' għerq oblikwu.Il-komposti 8, 9 u 15 bidlu d-direzzjoni tat-tkabbir ta 'l-għeruq f'75 μM, 50 μM, u 40 μM, rispettivament, li jindikaw li dawn il-komposti jistgħu jiddestabilizzaw b'mod effettiv il-mikrotubuli (Fig. 2b, 6a).Aħna ttestjajna wkoll id-derivattiv tal-aċidu ursoliku l-aktar qawwi, KAND 11, f'konċentrazzjoni aktar baxxa (15 µM) u sibna li l-applikazzjoni ta 'KAND 11 inibixxi t-tkabbir tal-għeruq u li d-direzzjoni tat-tkabbir tal-għeruq kienet irregolari, għalkemm kellhom it-tendenza li jinżlu lejn ix-xellug ( Figura C3)..Minħabba li konċentrazzjonijiet ogħla ta 'drogi li jiddestabilizzaw il-mikrotubuli kultant jinibixxu t-tkabbir tal-pjanti aktar milli jikkawżaw l-għerq ta' l-għeruq, sussegwentement ivvalutajna l-possibbiltà li KAND 11 jaffettwa mikrotubuli billi josservaw mikrotubuli kortikali fiċ-ċelloli epidermali ta 'l-għeruq.L-immunoistokimika bl-użu ta 'antikorpi anti-β-tubulin f'ċelloli epidermali ta' għeruq ta 'nebbieta ttrattati b'25 μM KAND 11 wriet l-għajbien ta' kważi l-mikrotubuli kortikali kollha fiċ-ċelloli epidermali fiż-żona ta 'titwil (Fig. 6b).Dawn ir-riżultati jindikaw li l-aċidu kumamotonic u d-derivattivi tiegħu jaġixxu direttament jew indirettament fuq il-mikrotubuli biex ifixkluhom u li dawn il-komposti huma inibituri ġodda tal-mikrotubuli.
L-aċidu ursoniku u d-derivattivi tiegħu jbiddlu l-mikrotubuli kortikali f'Arabidopsis thaliana.(a) Angolu tal-inklinazzjoni tal-għeruq imkejjel fil-preżenza ta' diversi derivattivi tal-aċidu urmotoniku fil-konċentrazzjonijiet indikati.Ġew analizzati wkoll l-effetti ta 'żewġ komposti magħrufa li jinibixxu l-mikrotubuli: disopyramide u oryzalin.Id-daħla turi l-istandard użat biex jitkejjel l-angolu tat-tkabbir tal-għeruq.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bi trattament simulat (test t, p< 0.05).n>19. Skala bar = 1 ċm.(b) Mikrotubuli kortikali fiċ-ċelloli epidermali fiż-żona ta 'titwil.Mikrotubuli f'għeruq ta 'Arabidopsis Col tat-tip selvaġġ imkabbra fuq pjanċi MS bi jew mingħajr 25 μM KAND 11 ġew viżwalizzati permezz ta' tbajja immunoistokimika bl-użu ta 'antikorpi primarji β-tubulin u antikorpi sekondarji Alexa Fluor konjugati.Skala bar = 10 µm.(c) Struttura mitotika tal-mikrotubuli fil-meristem tal-għerq.Il-mikrotubuli ġew viżwalizzati bl-użu ta 'tbajja' immunoistokimiku.Strutturi mitotiċi, inklużi żoni tal-profażi, magħżel, u phragmoplasts, ġew magħduda minn stampi konfokali.Il-vleġeġ jindikaw strutturi tal-mikrotubuli mitotiċi.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bi trattament simulat (test t, p< 0.05).n>9. Skala bar = 50 µm.
Għalkemm Ursa għandha l-abbiltà li tfixkel il-funzjoni tal-mikrotubuli, il-mekkaniżmu ta 'azzjoni tagħha huwa mistenni li jkun differenti minn aġenti tipiċi ta' depolimerizzazzjoni tal-mikrotubuli.Pereżempju, konċentrazzjonijiet ogħla ta 'aġenti depolimerizzanti tal-mikrotubuli bħal disopyramide u oryzalin jinduċu espansjoni anisotropika ta' ċelloli epidermali, filwaqt li KAND 11 ma jagħmilx hekk.Barra minn hekk, l-applikazzjoni konġunta ta 'KAND 11 u disopyramide rriżultat f'rispons tat-tkabbir ta' l-għeruq indott minn disopyramide u ġiet osservata inibizzjoni tat-tkabbir indotta minn KAND 11 (Fig. S4).Aħna analizzajna wkoll ir-rispons tal-mutant disopyramide 1-1 (phs1-1) ipersensittiv għal KAND 11. phs1-1 għandu mutazzjoni tal-punt tubulin kinase mhux kanoniku u jipproduċi għeruq iqsar meta jiġi ttrattat b'disopyramide9,20.Nebbieta mutanti phs1-1 imkabbra fuq medium agar li fih KAND 11 kellhom għeruq iqsar simili għal dawk imkabbra fuq disopyramid (fig. S5).
Barra minn hekk, osservajna strutturi tal-mikrotubuli mitotiċi, bħal żoni prophase, magħżel, u phragmoplasts, fil-meristem tal-għeruq ta 'nebbieta ttrattati b'KAND 11. Konsistenti mal-osservazzjonijiet għal CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS, tnaqqis sinifikanti fil- in-numru ta 'mikrotubuli mitotiċi kien osservat (Fig. .6c).
Biex tikkaratterizza ċ-ċitotossiċità ta 'KAND 11 f'riżoluzzjoni subċellulari, aħna kkurajna ċelloli ta' sospensjoni tat-tabakk BY-2 b'KAND 11 u osservajna r-rispons tagħhom.L-ewwel żidna KAND 11 maċ-ċelluli BY-2 li jesprimu TagRFP-TUA6, li tittikkettja mikrotubuli b'mod fluworexxenti, biex tevalwa l-effett ta 'KAND 11 fuq mikrotubuli kortikali.Id-densità tal-mikrotubuli kortikali ġiet evalwata bl-użu ta 'analiżi tal-immaġni, li kkwantifikat il-perċentwal ta' pixels ċitoskeletali fost pixels ċitoplasmiċi.Ir-riżultati tal-assaġġ urew li wara t-trattament b'50 μM jew 100 μM KAND 11 għal siegħa, id-densità naqset b'mod sinifikanti għal 0.94 ± 0.74% jew 0.23 ± 0.28%, rispettivament, filwaqt li d-densità taċ-ċelluli ttrattati b'DMSO, ammontat għal ± 1034. % (Fig. 7a).Dawn ir-riżultati huma konsistenti mal-osservazzjoni f'Arabidopsis li t-trattament KAND 11 jinduċi depolimerizzazzjoni ta 'mikrotubuli kortikali (Fig. 6b).Aħna eżaminajna wkoll il-linja BY-2 b'filamenti ta 'actin ittikkettati bil-GFP-ABD wara trattament bl-istess konċentrazzjoni ta' KAND 11 u osservajna li t-trattament KAND 11 ħarbat il-filamenti ta 'l-actin.Trattament b'50 μM jew 100 μM KAND 11 għal 1 siegħa naqqas b'mod sinifikanti d-densità tal-filament ta 'l-actin għal 1.20 ± 0.62% jew 0.61 ± 0.26%, rispettivament, filwaqt li d-densità fiċ-ċelloli ttrattati b'DMSO kienet ta' 1.69 ± 0.69 ± .7b).Dawn ir-riżultati jikkuntrastaw mal-effetti tal-propyzamide, li ma jaffettwax il-filamenti tal-actin, u latrunculin B, depolimerizzatur tal-actin li ma jaffettwax il-mikrotubuli (SI Figura S6).Barra minn hekk, it-trattament b'coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, jew KAND 11 ma affettwax mikrotubuli fiċ-ċelloli HeLa (SI Figura S7).Għalhekk, il-mekkaniżmu ta 'azzjoni ta' KAND 11 huwa maħsub li huwa differenti minn dak ta 'disruptors magħrufa taċ-ċitoskeletru.Barra minn hekk, l-osservazzjoni mikroskopika tagħna taċ-ċelluli BY-2 ittrattati b'KAND 11 żvelat il-bidu tal-mewt taċ-ċelluli waqt it-trattament KAND 11 u wriet li l-proporzjon ta 'ċelluli mejta Evans imtebba' blu ma żdiedx b'mod sinifikanti wara 30 min ta' trattament KAND 11, billi wara 90 minuta ta 'trattament b'50 μM jew 100 μM KAND, in-numru ta' ċelluli mejta żdied għal 43.7% jew 80.1%, rispettivament (Fig. 7c).Meħuda flimkien, din id-dejta tindika li d-derivattiv ġdid tal-aċidu ursoliku KAND 11 huwa inibitur ċitoskeletali speċifiku għall-pjanti b'mekkaniżmu ta 'azzjoni mhux magħruf qabel.
KAND jaffettwa l-mikrotubuli kortikali, il-filamenti tal-actin, u l-vijabbiltà taċ-ċelloli BY-2 tat-tabakk.(a) Viżwalizzazzjoni ta 'mikrotubuli kortikali fiċ-ċelloli BY-2 fil-preżenza ta' TagRFP-TUA6.Ċelloli BY-2 ittrattati b'KAND 11 (50 μM jew 100 μM) jew DMSO ġew eżaminati b'mikroskopija konfokali.Id-densità tal-mikrotubuli kortikali ġiet ikkalkulata minn mikrografi ta '25 ċellula indipendenti.L-ittri jindikaw differenzi sinifikanti (Tukey HSD test, p< 0.05).Skala bar = 10 µm.(b) Filamenti tal-aktina kortikali fiċ-ċelloli BY-2 viżwalizzati fil-preżenza ta 'GFP-ABD2.Ċelloli BY-2 ittrattati b'KAND 11 (50 μM jew 100 μM) jew DMSO ġew eżaminati b'mikroskopija konfokali.Id-densità tal-filamenti ta 'l-actin kortikali ġiet ikkalkulata minn mikrografi ta' 25 ċellula indipendenti.L-ittri jindikaw differenzi sinifikanti (Tukey HSD test, p< 0.05).Skala bar = 10 µm.(c) Osservazzjoni ta 'ċelluli BY-2 mejta permezz ta' tbajja blu Evans.Iċ-ċelloli BY-2 ittrattati b'KAND 11 (50 μM jew 100 μM) jew DMSO ġew eżaminati b'mikroskopija b'kamp qawwi.n=3.Skala bar = 100 µm.
L-iskoperta u l-applikazzjoni ta 'prodotti naturali ġodda wasslu għal avvanzi sinifikanti f'diversi aspetti tal-ħajja tal-bniedem, inklużi l-mediċina u l-agrikoltura.Saret riċerka storika biex jinkisbu komposti utli mir-riżorsi naturali.B'mod partikolari, l-actinomycetes huma magħrufa li huma utli bħala antibijotiċi antiparassitiċi għan-nematodi minħabba l-kapaċità tagħhom li jipproduċu diversi metaboliti sekondarji bħall-avermectin, il-kompost ewlieni ta 'ivermectin u bleomycin u d-derivattivi tiegħu, użati mediċinali bħala aġent kontra l-kanċer21,22.Bl-istess mod, ġew skoperti varjetà ta 'komposti erbiċidali mill-actinomycetes, li wħud minnhom diġà jintużaw kummerċjalment1,23.Għalhekk, l-analiżi tal-metaboliti ta 'l-actinomycete biex jiġu iżolati prodotti naturali b'attivitajiet bijoloġiċi mixtieqa hija meqjusa bħala strateġija effettiva.F'dan l-istudju, skoprejna kompost ġdid, coumamonamide, minn S. werraensis u sintetizzawh b'suċċess.L-aċidu ursoniku huwa intermedju sintetiku ta 'urbenamide u d-derivattivi tiegħu.Jista 'jikkawża ħdejjed ta' l-għeruq karatteristika, juri attività erbiċida moderata għal qawwija, u direttament jew indirettament jagħmel ħsara lill-mikrotubuli tal-pjanti.Madankollu, il-mekkaniżmu ta 'azzjoni ta' l-aċidu urmotoniku jista 'jkun differenti minn dak ta' inibituri tal-mikrotubuli eżistenti, peress li KAND 11 wkoll ifixkel il-filamenti ta 'l-actin u jikkawża mewt taċ-ċelluli, li jissuġġerixxi mekkaniżmu regolatorju li permezz tiegħu l-aċidu urmotoniku u d-derivattivi tiegħu jinfluwenzaw firxa wiesgħa ta' strutturi ċitoskeletali..
Karatterizzazzjoni dettaljata ulterjuri ta 'aċidu urbenoniku tgħin biex tifhem aħjar il-mekkaniżmu ta' azzjoni ta 'aċidu urbenoniku.B'mod partikolari, l-għan li jmiss huwa li tevalwa l-kapaċità tal-aċidu ursoniku li jorbot ma 'mikrotubuli mnaqqsa biex jiddetermina jekk l-aċidu ursoniku u d-derivattivi tiegħu jaġixxux direttament fuq mikrotubuli u jiddepolimerizzawhom, jew jekk l-azzjoni tagħhom tirriżultax f'destabilizzazzjoni tal-mikrotubuli.Barra minn hekk, fil-każ fejn il-mikrotubuli mhumiex mira diretta, l-identifikazzjoni tas-sit tal-azzjoni u l-miri molekulari tal-aċidu ursoniku fuq iċ-ċelloli tal-pjanti se tgħin biex tifhem aktar il-proprjetajiet ta 'komposti relatati u modi possibbli biex tittejjeb l-attività erbiċida.L-assaġġ tal-bijoattività tagħna żvela l-abbiltà ċitotossika unika tal-aċidu ursoniku fuq it-tkabbir ta 'pjanti bħal Arabidopsis thaliana, tabakk u liverwort, filwaqt li la E. coli u lanqas ċelluli HeLa ma ġew affettwati.Ftit jew xejn tossiċità għaċ-ċelloli tal-annimali hija vantaġġ tad-derivattivi tal-aċidu ursoniku jekk jiġu żviluppati bħala erbiċidi għall-użu f'għelieqi agrikoli miftuħa.Tabilħaqq, peress li l-mikrotubuli huma strutturi komuni fl-ewkarjoti, l-inibizzjoni selettiva tagħhom fil-pjanti hija rekwiżit ewlieni għall-erbiċidi.Pereżempju, propyzamide, aġent depolimerizzanti tal-mikrotubuli li jeħel direttament mat-tubulina u jinibixxi l-polimerizzazzjoni, jintuża bħala erbiċida minħabba t-tossiċità baxxa tiegħu għaċ-ċelloli tal-annimali24.B'kuntrast ma' disopyramide, benzamidi relatati għandhom speċifiċitajiet differenti fil-mira.Minbarra l-mikrotubuli tal-pjanti, RH-4032 jew benzoxamide jinibixxi wkoll mikrotubuli ta 'ċelluli tal-annimali jew oomycetes, rispettivament, u zalilamide jintuża bħala funġiċida minħabba l-fitotossiċità baxxa tiegħu25,26,27.L-ors li għadu kif ġie skopert u d-derivattivi tiegħu juru ċitotossiċità selettiva kontra l-pjanti, iżda ta 'min jinnota li aktar modifiki jistgħu jbiddlu l-ispeċifiċità fil-mira tagħhom, potenzjalment jipprovdu derivattivi addizzjonali għall-kontroll ta' fungi patoġeniċi jew oomycetes.
Il-proprjetajiet uniċi tal-aċidu urbenoniku u d-derivattivi tiegħu huma utli għall-iżvilupp tagħhom bħala erbiċidi u l-użu bħala għodod ta 'riċerka.L-importanza taċ-ċitoskeletru fil-kontroll tal-forma taċ-ċelluli tal-pjanti hija rikonoxxuta b'mod wiesa '.Studji preċedenti wrew li l-pjanti evolvew mekkaniżmi kumplessi ta 'organizzazzjoni tal-mikrotubuli kortikali billi jikkontrollaw id-dinamika tal-mikrotubuli biex jikkontrollaw sew il-morfoġenesi.Ġew identifikati numru kbir ta 'molekuli responsabbli għar-regolazzjoni tal-attività tal-mikrotubuli, u r-riċerka relatata għadha għaddejja3,4,28.Il-fehim attwali tagħna tad-dinamika tal-mikrotubuli fiċ-ċelloli tal-pjanti ma jispjegax bis-sħiħ il-mekkaniżmi tal-organizzazzjoni tal-mikrotubuli kortikali.Pereżempju, għalkemm kemm disopyramide kif ukoll oryzalin jistgħu jiddepolimerizzaw il-mikrotubuli, disopyramide jikkawża distorsjoni severa tal-għeruq filwaqt li oryzalin għandu effett relattivament ħafif.Barra minn hekk, mutazzjonijiet fit-tubulina, li jistabbilizza l-mikrotubuli, jikkawżaw ukoll destrorotazzjoni fl-għeruq, filwaqt li paclitaxel, li jistabbilizza wkoll id-dinamika tal-mikrotubuli, ma jagħmilx hekk.Għalhekk, l-istudju u l-identifikazzjoni tal-miri molekulari tal-aċidu ursoliku għandhom jipprovdu għarfien ġdid dwar ir-regolamentazzjoni tal-mikrotubuli kortikali tal-pjanti.Bl-istess mod, paraguni futuri ta 'kimiċi li huma effettivi fil-promozzjoni ta' tkabbir distort, bħal disopyramide, u kimiċi inqas effettivi, bħal oryzalin jew aċidu kumamotoriku, se jipprovdu ħjiel dwar kif iseħħ tkabbir distort.
Min-naħa l-oħra, arranġamenti mill-ġdid taċ-ċitoskeletri relatati mad-difiża huma possibbiltà oħra biex tispjega ċ-ċitotossiċità tal-aċidu ursoniku.Infezzjoni ta' patoġenu jew introduzzjoni ta' elicitor fiċ-ċelloli tal-pjanti kultant tikkawża l-qerda taċ-ċitoskeletru u mewt taċ-ċelluli sussegwenti29.Pereżempju, il-kriptoxanthin derivat minn oomycete ġie rrappurtat li jfixkel il-mikrotubuli u l-filamenti tal-actin qabel il-mewt taċ-ċelluli tat-tabakk, simili għal dak li jseħħ bit-trattament KAND30,31.Ix-xebh bejn ir-risponsi tad-difiża u r-risponsi ċellulari indotti mill-aċidu ursoniku wassalna biex nissuponu li jikkawżaw proċessi ċellulari komuni, għalkemm effett aktar mgħaġġel u b'saħħtu ta 'aċidu ursoniku minn kriptoxanthin huwa evidenti.Madankollu, studji wrew li t-tfixkil tal-filamenti tal-actin jippromwovi l-mewt spontanja taċ-ċelluli, li mhux dejjem tkun akkumpanjata minn tfixkil tal-mikrotubuli29.Barra minn hekk, għad irid jara jekk jew il-patoġenu jew l-elicitor jikkawżax tkabbir tal-għeruq distort, kif jagħmlu d-derivattivi tal-aċidu ursoniku.Għalhekk, l-għarfien molekulari li jgħaqqad ir-risponsi tad-difiża u ċ-ċitoskeletru huwa problema attraenti li trid tiġi indirizzata.Billi jisfruttaw il-preżenza ta 'komposti ta' piż molekulari baxx relatati mal-aċidu ursoniku, kif ukoll firxa ta 'derivattivi b'potenzi differenti, jistgħu jipprovdu opportunitajiet biex jimmiraw mekkaniżmi ċellulari mhux magħrufa.
Meħuda flimkien, l-iskoperta u l-applikazzjoni ta 'komposti ġodda li jimmodulaw id-dinamika tal-mikrotubuli se jipprovdu metodi b'saħħithom biex jindirizzaw il-mekkaniżmi molekulari kumplessi sottostanti d-determinazzjoni tal-forma taċ-ċelluli tal-pjanti.F'dan il-kuntest, l-aċidu urmotoniku kompost żviluppat reċentement, li jaffettwa mikrotubuli u filamenti ta 'actin u jinduċi mewt taċ-ċelluli, jista' jipprovdi opportunità biex jiġi deċifrat il-konnessjoni bejn il-kontroll tal-mikrotubuli u dawn il-mekkaniżmi l-oħra.Għalhekk, l-analiżi kimika u bijoloġika bl-użu ta 'aċidu urbenoniku tgħinna nifhmu l-mekkaniżmi regolatorji molekulari li jikkontrollaw iċ-ċitoskeletru tal-pjanti.
Inokula S. werraensis MK493-CF1 fi flixkun Erlenmeyer baffled ta' 500 mL li fih 110 mL ta' medium taż-żerriegħa li jikkonsisti minn 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence pasta, 1% (w/v) Kompożizzjoni Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) estratt tal-qamħ (KOGOSTCH Co., Ltd., Ġappun), 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4 u 0.2% CaCO3 f'ilma dejonizzat.(pH 7.4 qabel l-isterilizzazzjoni).Il-kulturi taż-żerriegħa ġew inkubati fuq rotary shaker (180 rpm) f'27 ° C għal jumejn.Il-kultivazzjoni tal-produzzjoni permezz tal-fermentazzjoni fl-istat solidu.Il-kultura taż-żerriegħa (7 ml) ġiet trasferita fi flixkun K-1 ta’ 500 ml li kien fih 40 g ta’ medju ta’ produzzjoni li jikkonsisti fi 15 g ta’ xgħir ippressat (MUSO Co., Ltd., Ġappun) u 25 g ta’ ilma dejonizzat (pH mhux aġġustat). qabel l-isterilizzazzjoni).).Il-fermentazzjoni saret fi 30°C fid-dlam għal 14-il jum.Il-materjal tal-fermentazzjoni ġie estratt b'40 ml/flixkun EtOH u ċentrifugat (1500 g, 4 ° C, 10 min).Is-supernatant tal-kultura (60 ml) ġie estratt b'taħlita ta' 10% MeOH/EtOAc.Is-saff organiku ġie evaporat taħt pressjoni mnaqqsa biex jinkiseb residwu (59.5 mg), li kien soġġett għal HPLC b'eluzzjoni gradjent (0-10 minuti: 90%) fuq kolonna b'fażi inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × tul 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minuta: 90% H2O/CH3CN sa 70% H2O/CH3CN (gradjent), 35-45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45-155 minuta: 90% H2O /EtOH għal 100% EtOH (gradjent (gradjent), 155-200 min: 100% EtOH) b'rata ta 'fluss ta' 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) kien iżolat bħala trab amorfu abjad.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valur ikkalkulat: 141.0659, valur imkejjel: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Żrieragħ Columbia (Col-0) inkisbu miċ-Ċentru tar-Riżorsi Bijoloġiċi Arabidopsis (ABRC) b'permess għall-użu tar-riċerka.Żrieragħ Col-0 ġew propagati u miżmuma taħt il-kundizzjonijiet tal-laboratorju tagħna u użati bħala pjanti Arabidopsis tat-tip selvaġġ.Iż-żerriegħa ta' Arabidopsis ġew sterilizzati fil-wiċċ u kkultivati f'nofs Murashige u Skoog medju li fih 2% sukrożju (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) u 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, fi 23 °C u dawl kostanti.Iż-żrieragħ tal-mutant phs1-1 ġew ipprovduti minn T. Hashimoto (Istitut tax-Xjenza u t-Teknoloġija ta 'Nara).
Żrieragħ tar-razza SR-1 ġew ipprovduti minn T. Hashimoto (Istitut tax-Xjenza u Teknoloġija ta 'Nara) u użati bħala pjanti tat-tabakk tat-tip selvaġġ.Iż-żerriegħa tat-tabakk ġew sterilizzati fil-wiċċ u mxarrba f'ilma sterili għal tlett iljieli biex jippromwovu l-ġerminazzjoni, imbagħad imqiegħda f'soluzzjoni ta 'nofs qawwa li fiha 2% sukrożju, 0.05% (w/v) MES, u 0.8% gomma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.u Skoog medium) b'pH 5.7 u inkubati f'23°C taħt dawl kostanti.
Strain Tak-1 ġie pprovdut minn T. Kohchi (Università ta 'Kyoto) u ntużat bħala l-unità sperimentali standard għall-istudju tal-liverwort.Gemma nkisbet minn pjanti kkultivati sterilizzati u mbagħad miksija fuq medju Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) li fih 1% sukrożju u 0.3% gomma gellan u inkubata f'23 ° C taħt dawl kontinwu.
Ċelloli tat-tabakk BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ġew ipprovduti minn S. Hasezawa (Università ta 'Tokjo).Iċ-ċelloli BY-2 ġew dilwiti 95 darbiet f'medja Linsmeier u Skoog modifikat u supplimentati kull ġimgħa b'aċidu 2,4-dichlorophenoxyacetic 32.Is-sospensjoni taċ-ċelluli tħallat fuq rotary shaker f'130 rpm f'27°C fid-dlam.Aħsel iċ-ċelloli b'10 darbiet il-volum ta 'medja friska u erġa' ssospendi fl-istess medju.Linji taċ-ċelluli transġeniċi BY-2 li jesprimu b'mod stabbli l-markatur tal-mikrotubuli TagRFP-TUA6 jew il-markatur tal-filament actin GFP-ABD2 taħt il-promotur tal-virus tal-mużajk tal-pastard 35S ġew iġġenerati kif deskritt33,34,35.Dawn il-linji taċ-ċelluli jistgħu jinżammu u jiġu sinkronizzati bl-użu ta 'proċeduri simili għal dawk użati għal-linja taċ-ċelluli oriġinali BY-2.
Iċ-ċelloli HeLa ġew ikkultivati fil-mezz Eagle modifikat ta 'Dulbecco (DMEM) (Teknoloġiji tal-Ħajja) supplimentat b'10% serum bovin fetali, 1.2 U/ml peniċillina, u 1.2 μg/ml streptomycin f'inkubatur ta' 37 ° C b'5% CO2.
L-esperimenti kollha deskritti f'dan il-manuskritt saru skont ir-regolamenti u l-linji gwida Ġappuniżi dwar il-bijosigurtà.
Il-komposti ġew maħlula f'dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) bħala soluzzjonijiet stokk u dilwit f'medja MS għal Arabidopsis u tabakk jew medju Gamborg B5 għal liverwort.Għall-assaġġ ta 'inibizzjoni tat-tkabbir ta' l-għeruq, aktar minn 10 żerriegħa għal kull pjanċa ġew miżrugħa fuq medium agar li kien fih il-komposti indikati jew DMSO.Iż-żrieragħ ġew inkubati f'kamra tat-tkabbir għal 7 ijiem.In-nebbieta ġew ritratti u t-tul tal-għeruq ġie mkejjel.Għall-assaġġ ta 'ġerminazzjoni ta' Arabidopsis, 48 żerriegħa għal kull pjanċa nżergħu fuq medium agar li kien fih kompost 200 μM jew DMSO.Iż-żrieragħ ta 'Arabidopsis tkabbru f'kamra tat-tkabbir u n-numru ta' nebbieta ġerminati kien magħdud 7 ijiem wara l-ġerminazzjoni (dag).Għall-assaġġ tal-ġerminazzjoni tat-tabakk, 24 żerriegħa għal kull pjanċa nżergħu fuq medium agar li kien fih 200 μM KAND jew DMSO.Żrieragħ tat-tabakk tkabbru f'kamra tat-tkabbir u n-numru ta 'nebbieta ġerminati kien magħdud wara 14-il jum.Għall-assaġġ ta 'inibizzjoni tat-tkabbir tal-fwied, 9 embrijuni minn kull pjanċa ġew ibbanjati fuq medium agar li kien fih il-konċentrazzjonijiet indikati ta' KAND jew DMSO u inkubati f'kamra tat-tkabbir għal 14-il jum.
Uża nebbieta mtebbgħin b'5 mg/ml propidium iodide (PI) biex tara l-organizzazzjoni tal-meristemi tal-għeruq.Sinjali PI ġew osservati permezz ta 'mikroskopija fluworexxenti bl-użu ta' mikroskopju tal-iskannjar tal-laser konfokali TCS SPE (Leica Microsystems).
Tbajja istokimika tal-għeruq b'β-glucuronidase (GUS) saret skont il-protokoll deskritt minn Malami u Benfey36.In-nebbieta ġew iffissati f'90% aċetun matul il-lejl, imtebbgħin b'0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid f'buffer GUS għal siegħa u mqiegħda f'soluzzjoni ta 'chloraldehyde idratat.(8 g chloral hydrate, 2 ml ilma u 1 ml gliċerol) u osservati b'mikroskopija ta' kuntrast ta' interferenza differenzjali bl-użu ta' mikroskopju Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
L-angoli ta 'l-għeruq ġew imkejla fuq nebbieta ta' 7 ijiem imkabbra fuq pjanċi mqiegħda vertikalment.Kejjel l-angolu tal-għerq mid-direzzjoni tal-vettur tal-gravità kif deskritt fil-pass 6.
L-arranġament tal-mikrotubuli kortikali ġie osservat kif deskritt, b'modifiki minuri għall-protokoll 37 .Antikorp anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) u Alexa Fluor 488-konjugat kontra l-ġurdien IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) intużaw bħala antikorpi primarji u sekondarji f'dilwizzjonijiet 1:1000 u 1:100, rispettivament.Immaġini ta 'fluworexxenza ġew akkwistati bl-użu ta' mikroskopju tal-iskannjar tal-laser konfokali TCS SPE (Leica Microsystems).Akkwista immaġini Z-munzell u oħloq projezzjonijiet ta 'intensità massima skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
L-assaġġ tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli HeLa sar bl-użu ta' Cell Counting Kit 8 (Dojindo) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
It-tkabbir ta 'E. coli DH5α ġie analizzat billi titkejjel id-densità taċ-ċelluli fil-kultura bl-użu ta' spettrofotometru f'600 nm (OD600).
L-organizzazzjoni ċitoskeletali f'ċelluli transġeniċi BY-2 ġiet osservata bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti mgħammar b'apparat ta' skanjar konfokali CSU-X1 (Yokogawa) u kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).Id-densità taċ-ċitoskeletriċi ġiet evalwata b'analiżi tal-immaġni, li kkwantifikat il-perċentwal ta 'pixels ċitoskeletriċi fost pixels ċitoplasmiċi f'immaġini konfokali bl-użu ta' softwer ImageJ kif deskritt38,39.
Biex tiskopri l-mewt taċ-ċelluli fiċ-ċelloli BY-2, alikwot tas-sospensjoni taċ-ċelluli ġiet inkubata b'0.05% Evans blu għal 10 minuti f'temperatura ambjentali.It-tbajja selettiva tal-blu Evans taċ-ċelloli mejta tiddependi fuq l-estrużjoni taż-żebgħa minn ċelloli vijabbli mill-membrana tal-plażma intatta40.Ċelloli mtebbgħin ġew osservati bl-użu ta 'mikroskopju bright-field (BX53, Olympus).
Iċ-ċelloli HeLa tkabbru f'DMEM supplimentat b'10% FBS f'inkubatur umidifikat f'37 ° C u 5% CO2.Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), jew 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) għal 6 sigħat f'37 ° C.Iċ-ċelloli ġew iffissati b'MetoH għal 10 min u mbagħad bl-aċetat għal 5 min f'temperatura tal-kamra.Ċelloli fissi ġew inkubati b'antikorp primarju β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) dilwit f'0.5% BSA/PBS għal sagħtejn, maħsula 3 darbiet b'TBST, u mbagħad inkubati b'antikorp tal-mogħoż Alexa Fluor.488 1 siegħa.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) u 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilwit f'0.5% BSA/PBS.Wara l-ħasil bit-TBST tliet darbiet, ġew osservati ċelloli mtebbgħin fuq mikroskopju invertit Nikon Eclipse Ti-E.Immaġini nqabdu b'kamera Hamamatsu ORCA-R2 CCD mkessħa bl-użu ta 'softwer MetaMorph (Apparat Molekulari).
Ħin tal-post: Ġunju-17-2024